2012 Fiscal Year Research-status Report
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24580284
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
森友 忠昭 日本大学, 生物資源科学部, 准教授 (20239677)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | ペルパーT細胞亜集団 |
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| Research Abstract |
目的：我々はコイのCD4+T細胞（Th細胞）が単クローン性に増殖できる培養系を確立しており、これまでに哺乳類のTｈ亜集団の1つであるTh2様のクローンを得ている。そこで本研究では、さらに多くのクローンを作製し、それらの性状を解析することで、魚類Th亜集団の探索を試みた。
方法：支持細胞層を形成させた25cm²フラスコ上で、コイ腎臓白血球を20%FBS及び2.5%コイ血清を添加したE-RDF培地で培養した（バルク培養）。これにより増殖した細胞を顕微鏡下で１細胞ずつ分取し、支持細胞層を形成させた96穴プレートの各穴に1細胞ずつ播種した。これらの1細胞からコロニーを形成させ、さらに拡大培養を行った。なお、培養液にはバルク培養の上清と、T細胞増殖因子であるコイIL-2のリコンビナントタンパク（ｒIL2）を作製し、添加した。
結果：上述の培養系でｒIL2を添加したところ、無添加の場合と比べ、コロニーが形成されたウェル数が約2倍に上昇した。得られたT細胞クローンを継代したところ、3つのクローンにおいて長期培養が可能となった(クローンNo.1, No.2, No.3)。これらのクローンはTCR-α, -β, 及びCD4-1の発現が見られたが、CD4-2, CD8α及びCD8βの発現は見られなかった。次に、各クローンをT細胞マイトジェンであるPHAで刺激し、刺激後に発現量が上昇するTh関連サイトカイン遺伝子を調べたところ、クローンNo.1では魚類のTh2サイトカインであるIL-4/13A及びIL-4/13Bの発現上昇が見られたが、クローンNo.2ではTh1サイトカインであるINFgの発現上昇が見られた。
以上のことから、魚類においてもTh1およびTh2亜集団が存在することが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
真骨魚類は，哺乳類と同様，T・B細胞を主体とした獲得免疫機構を持つ．そのため獲得免疫反応の中心的な制御機構を構成するTh亜集団の存在や性状を調べることは，魚病の病態解明・予防・ワクチン開発などに大きく貢献するものと思われる．このような背景から，近年魚類でも，Th亜集団の同定に向けた多くの研究が行われて来ている．しかし，その多くは，哺乳類遺伝子との相同性に基づく，魚類Th関連遺伝子の単離と，臓器・組織レベルの発現解析によるものであり，魚類Th亜集団の存在を直接証明していない．また，最近では，Th表面マーカー遺伝子の組換えタンパク質の合成と，それに対する抗体を作製し，哺乳類のTreg類似の集団をミドリフグで分離できたとの報告もある．しかし，この手法も，アイソフォーム遺伝子の多い魚類では，抗体の特異性が問題となったり，また，魚類に特有のTh亜集団を見逃したりする可能性もある．一方，我々が行うクローン化T細胞株の作製技術は，1個のTh細胞から増幅させるため，細胞の均一性は完全に担保される．また，哺乳類には無い，魚類特有のTh亜集団も発見できる可能もある．この様に，申請者らの取組みは，従来の研究手法と一線を隔すものであり，いままでにない，新たな発見が期待できる．
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| Strategy for Future Research Activity |
Th亜集団の同定には，Th1サイトカイン（IFNγ2・TNFα），Th2サイトカイン（IL4/13A，IL4/13B，IL10），Th17サイトカイン（IL17，IL22）およびTregサイトカイン（TGFβ，IL10）などの発現解析を各細胞株について行なう必要がある．また，哺乳類Th亜集団のそれぞれの分化や機能維持には，特異的な転写因子の発現が重要である．すなわち，Th1，Th2，Th17およびTregにはそれぞれ，T-bet，GATA3，RORγtおよびFoxP3が発現していると考えられる．そこで，これら転写因子遺伝子についても，各細胞株で発現の有無を調べ，サイトカイン産生パターンと合わせて，Th亜集団の同定を行う．
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
該当なし．
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[Journal Article] Expression profiles of interferon gamma genes in response to immunostimulants and alloantigen in ginbuna crucian carp Carassius auratus langsdorfii2013
Author(s)
Araki, K., Takizawa, F., Yamasaki, M., Esumi, M., Moritomo, T., Ototake, M., Yamamoto, A., and Nakanishi, T
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Journal Title
Fisheries science
Volume: 79
Pages: 213-220
DOI
Peer Reviewed
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