2012 Fiscal Year Research-status Report
虚血誘導性Ｇ蛋白活性調節因子を介する病態制御機構の解明
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24590280
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Aichi Medical University |
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Principal Investigator |
佐藤 元彦 愛知医科大学, 医学部, 教授 (40292122)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
西村 直記 愛知医科大学, 医学部, 講師 (40278362)
佐藤 麻紀 愛知医科大学, 医学部, 助教 (60351102)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | シグナル伝達 / Ｇ蛋白質 / 心筋保護 / 循環器・呼吸器 |
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| Research Abstract |
GST融合蛋白を用いたAGS8のＧβγ作用部位の同定：AGS8の各領域をGST融合蛋白として大腸菌で作製し、精製Ｇβγと直接結合するかをpull-down assayで検討した。AGS8は200ｋｄに及ぶ蛋白であるので、大腸菌内で生成されやすい30-40kdの大きさに6分割し、それぞれの小部分をGST融合蛋白として作製した。６つのGST融合蛋白はどれも大腸菌内で合成可能で、可溶化蛋白として精製することができた。これらを用いてＧβγサブユニットが結合する部分をGST pull-downアッセイ法を用いて検討したところ、AGS8の中間部とC端にＧβγサブユニットが結合することが明らかになった。しかし、AGS8中間部のＧβγサブユニット結合部は細胞に導入しても、Ｇ蛋白シグナルを惹起しなかった。他方、AGS8-C端のＧβγサブユニット結合部は細胞内シグナルを惹起することがすでに明らかになっている（Sato M, et al. J Biol Chem. 2009;284:31431.）。そこで、以後の研究はAGS8のC端部位に注目しこの部分をさらに5分割しそれぞれの小部分をGST融合蛋白として作製した。５つのGST融合蛋白はどれも大腸菌内で合成可能で、可溶化蛋白として精製することができた。再度、GST pull-downアッセイ法を用いてＧβγサブユニット結合部分を検討したところ検討したところ、Ｇβγサブユニット結合部分は11-17kd(100-150アミノ酸)程度の範囲に絞ることができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成２４年度当初に予定した計画はすべて達成することができた。ＧＳＴ蛋白質は大腸菌内で生成されない、あるいは可溶化されない場合があるが、今回のＧＳＴ蛋白はすべて順調に作製することができた。また、作製蛋白を用いたpull-down assayによるＧβγサブユニット結合部分の同定も明快な結果が得られている。
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| Strategy for Future Research Activity |
AGS8上のＧβγ結合部位の特定とAGS8-Ｇβγ相互作用阻害ペプチド（AGS8関連ペプチド）の開発
1．AGS8-Ｇβγ相互作用を抑制するペプチドの同定：平成２４年度の検討で同定された、AGS8-Ｇβγ相互作用部位のアミノ酸配列に基づくペプチドを複数作製し、in vitro pull-down assayでAGS8とＧβγサブユニットの相互作用を阻害するか検討する。作製するペプチドは比較的安定して合成可能な30アミノ酸以下のものを予定している。これにより、AGS8上のＧβγ相互作用部位を30アミノ酸程度に限定することが可能になると予想する。
２．AGS8-Ｇβγ相互作用を抑制する効率的なペプチドの作製：上記実験で同定した複数のペプチドを検討し、より強い阻害作用を持つものを見出す。さらに得られたペプチドを基に、細胞内への導入が有利なより短いペプチド（20アミノ酸程度）を作製し、これのAGS8-Ｇβγ相互作用阻害効果を検討する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
本年度は研究実績に記載したとおりGST融合蛋白の作製が順調に進み、合成部位を変更しての再合成等が非常に少なかったため、合成に要する費用が軽減した。また、精製Ｇβγサブユニットを用いたGST pull-downアッセイも明快な結果が得られたため、試行回数が当初予定より少なくて済み、結果として精製Ｇβγサブユニットの購入量が少なくなり、これに要する費用が軽減した。
助成金は平成25年度分と合わせて、ペプチド合成に使用する予定である。今後の研究の推進方策に記載したペプチド合成は試行錯誤の部分があり、この部分に助成金を注力する。
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[Journal Article] Pharmacological stimulation of type 5 adenylyl cyclase stabilizes heart rate under both microgravity and hypergravity induced by parabolic flight.2012
Author(s)
Bai Y, Tsunematsu T, Jiao Q, Ohnuki Y, Mototani Y, Shiozawa K, Jin M, Cai W, Jin HL, Fujita T, Ichikawa Y, Suita K, Kurotani R, Yokoyama U, Sato Motohiko, Iwatsubo K, Ishikawa Y, Okumura S.
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Journal Title
Journal of Pharmacological Sciences
Volume: 119(4)
Pages: 381-389
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Inhibition of EP4 signaling attenuates aortic aneurysm formation.2012
Author(s)
Yokoyama U, Ishiwata R, Jin MH, Kato Y, Suzuki O, Jin H, Ichikawa Y, Kumagaya S, Katayama Y, Fujita T, Okumura S, Sato M, Sugimoto Y, Aoki H, Suzuki S, Masuda M, Minamisawa S, Ishikawa Y.
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Journal Title
PLoS One
Volume: 7(5)
Pages: e36724, 20a
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Effect of ascorbic acid on reactive oxygen species production in chemotherapy and hyperthermia in prostate cancer cells.2012
Author(s)
Fukumura H, Sato Motohiko, Kezuka K, Sato I, Feng X, Okumura S, Fujita T, Yokoyama U, Eguchi H, Ishikawa Y, Saito T.
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Journal Title
Journal of Physiological Sciences
Volume: 62(3)
Pages: 251-257
DOI
Peer Reviewed
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[Presentation] 身体半側多汗の病態機序.
Author(s)
犬飼洋子, 岩瀬敏, 西村直記, 佐藤麻紀, 清水祐樹, 桑原裕子, 菅屋潤壹, 佐藤元彦.
Organizer
第90回日本生理学会大会
Place of Presentation
タワーホール船堀（東京都）
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