2013 Fiscal Year Research-status Report
人工アミノ酸導入による２型リアノジン受容体チャネル活性制御とその破綻機構の解明
| Project/Area Number |
24590330
|
|---|
| Research Institution | Juntendo University |
|---|
Principal Investigator |
村山 尚 順天堂大学, 医学部, 准教授 (10230012)
|
|---|
| Keywords | リアノジン受容体 / 人工アミノ酸 / 相互作用 |
|---|
| Research Abstract |
本研究は人工アミノ酸を用いて2型リアノジン受容体(RyR2)のS4-S5リンカーを介する相互作用を同定し、チャネル活性制御と疾患変異による破綻の分子機構を明らかにすることを目的とした。
平成25年度は人工アミノ酸を導入するためのアミノアシルtRNA合成酵素（aaRS）とtRNAを効率的に発現させるシステムを構築した。人工アミノ酸の導入にはaaRSおよびtRNAを大量に発現する必要があるが、オリジナルの発現ベクターの細胞への導入はリポフェクション法により行うため、導入効率および発現量が十分でなかった。そこで改変バキュロウィルス発現系を開発してこれを使用した。バキュロウィルスのエンベロープにVSV-Gを発現するような改変を行ったところ、哺乳類細胞に効率良く感染するウィルスが得られた。このウィルスベクターにaaRSおよびtRNAをコードする配列を挿入してウィルスを作製しHEK細胞に感染させた結果、両者を大量に発現することが確認された。光架橋可能な人工アミノ酸であるp-benzoyl-phenylalanine（pBpa）を導入するため、RyR2の当該アミノ酸のコドンをアンバーコドン（TAG）に改変してHEK細胞に安定発現した。pBpa添加培地でaaRSおよびtRNA発現バキュロウィルスを感染させたところ、当該アミノ酸がpBpaに置換したRyR2の発現が確認された。現在、この変異RyR2の性質を検討している。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
平成25年度の計画では人工アミノ酸を導入したRyR2を発現させ、S4-S5リンカーと相互作用する部位を同定することを行う予定であった。人工アミノ酸の導入効率が予想外に低かったことから、当初の計画とは異なり、バキュロウィルスを利用した発現システムの構築が必要となった。そのため、相互作用部位の同定には至らなかった。
|
| Strategy for Future Research Activity |
平成26年度は25年度に計画していた人工アミノ酸導入RyR2を用いた相互作用部位の同定をはじめに行う。相互作用部位は光架橋により分子内結合したRyR2を精製後、トリプシン処理により限定分解して質量分析（MS/MS）する。光架橋処理を行わないものを対照にして、光架橋処理により生じたフラグメントを同定する。平成24年度に作製した疾患関連変異体についても同様な操作を行い、架橋部位の同定を行う。これらの結果から、相互作用部位に関する予測を行う予定である。
|
-
[Journal Article] Usefulness of running wheel for detection of congestive heart failure in dilated cardiomyopathy mouse model2013
Author(s)
Sugihara M, Odagiri F, Suzuki T, Murayama T, Nakazato Y, Unuma K, Yoshida K, Daida H, Sakurai T, Morimoto S, Kurebayashi N
-
Journal Title
PLoS ONE
Volume: 8
Pages: e55514
DOI
Peer Reviewed
-
[Journal Article] Overexpression of ryanodine receptor type 1 enhances mitochondrial fragmentation and Ca2+-induced ATP production in cardiac H9c2 myoblasts2013
Author(s)
O-Uchi J, Jhun BS, Hurst S, Bisetto S, Gross P, Chen M, Kettlewell S, Park J, Oyamada H, Smith GL, Murayama T, Sheu SS
-
Journal Title
Am J Physiol Heart Circ Physiol
Volume: 305
Pages: H1736-H1751
DOI
Peer Reviewed
-
-
[Journal Article] Sperm-associated antigen 4, a novel hypoxia-inducible factor 1 target, regulates cytokinesis, and its expression correlates with the prognosis of renal cell carcinoma2013
Author(s)
Shoji K, Murayama T, Mimura I, Wada T, Kume H, Goto A, Ohse T, Tanaka T, Inagi R, van der Hoorn FA, Manabe I, Homma Y, Fukayama M, Sakurai T, Hasegawa T, Aburatani H, Kodama T, Nangaku M
-
Journal Title
Am J Pathol
Volume: 182
Pages: 2191-2203
DOI
Peer Reviewed
-
-
