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2012 Fiscal Year Research-status Report

ゴルジ・小胞体ストレス応答によりもたらされる癌幹細胞自己複製機構の解明

Research Project

Project/Area Number 24590472
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research (C)

Research InstitutionAkita University

Principal Investigator

大森 泰文  秋田大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (90323138)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 吉岡 年明  秋田大学, 医学部, 講師 (80302264)
山本 洋平  秋田大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (70400512)
榎本 克彦  秋田大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (20151988)
Project Period (FY) 2012-04-01 – 2015-03-31
Keywordsコネキシン / 癌幹細胞 / 小胞体ストレス / ゴルジ体ストレス / ATF6α / 転移
Research Abstract

コネキシン32をゴルジ体に過剰発現する細胞システムの作製: ヒト肝細胞癌(HCC)由来の細胞株HuH7およびLi-7に対して、doxycycline (Dox)の有無でコネキシン32(Cx32)の発現を制御できるシステム(HuH7 Tet-off Cx32およびLi-7 Tet-off Cx32)を作製し、対照としてTet-off mock細胞も準備した。4 µg/ml Doxを培地に添加した際には外来性Cx32の発現が抑えられ、内因性Cx32のみが発現していたが、Doxを含まない通常の培地に変えることによりCx32をほぼ5倍まで過剰発現させることができた。これらの細胞をマウスに異種移植するin vivo実験の際には、飲料水に2 mg/ml Doxを添加することで外来性Cx32の発現を完全に抑えることができ、通常の飲料水を与えることで、Cx32の発現量を大幅に上昇させることができた。これらの細胞において、Cx32の細胞内局在を確認したところ、Cx32が細胞膜でギャップ結合を形成することはなく、ゴルジ体に局在していた。
癌幹細胞画分の解析とその自己複製の解析: side population(SP)と呼ばれる、Hoechst 33342蛍光色素の排出が亢進しこの色素に染まらない細胞集団をもって、癌幹細胞(CSC)とみなした。細胞回収後に生細胞をHoechst 33342で染色し、セルソーター(FACS)でSPの割合を測定した。CSCのnon-CSCへの成熟を抑制し、CSCの性質を維持した状態で培養するために、SPをFACSで分取し非接着性無血清培地内で培養した。この条件でCSCのみがsphereを形成し、このsphereの数とサイズを計測することで、CSCの自己複製能を評価した。以上によりCSCの数と自己複製能を解析するアッセイ法を確立した。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

本研究においては、Cx32のゴルジ体への貯留が、いかにして小胞体ストレス応答を惹起するのか、そしてこれがCSCの自己複製をいかに制御するのかを明らかにしていきたい。平成24年度中の研究において、上記目的を達成するための各種実験に必要なモデル細胞システムを作製するとともに、癌幹細胞を解析するためのアッセイ法を確立することができた。順調に計画が遂行されており、次年度の新たな段階の研究を遂行できる状況にある。

Strategy for Future Research Activity

ATF6の活性化状態の評価: 小胞体ストレス応答のシグナル伝達に関与するATF6は、不活化状態で小胞体に局在するが、ゴルジ体に移行すると、ゴルジ体にある2種のプロテアーゼ(S1PとS2P)により断片化される。プロセッシングを受ける前の不活化型ATF6は約90 kdであるが、プロセッシングを経た活性化型ATF6は約50 kdの断片となる。したがって、ウェスタンブロットで90 kdと50 kdのバンドを比較することにより、ATF6の活性化を評価する。
ATF6の発現量と活性化の抑制: ATF6の発現量もしくは活性化を抑制した際に、コネキシン32(Cx32)過剰発現に伴う癌幹細胞(CSC)の自己複製亢進が生じるかどうかを調べる。ATF6の発現量抑制のためには、ATF6に対するsiRNAを導入してノックダウンをし、活性化の抑制のためには、S1Pに対するsiRNAによりプロセッシング酵素をノックダウンする。
Cx32過剰発現に伴うATF6の動態の解析: 不活化型ATF6は小胞体に局在し、ゴルジ体を経て核内に移行する。そこで、Cx32の過剰発現を誘導した際のATF6の局在の変化を調べるために、細胞を経時的に免疫蛍光染色して共焦点顕微鏡で観察、Cx32の過剰発現に伴う局在の変化を解析する。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

本年度予定していた実験に必要な試薬キットが生産ラインのトラブルで販売が休止しており、次年度7月に生産が再開されることになったので、本年度の研究費を次年度に繰り越した。その他、各種抗体や試薬等の消耗品、実験動物、国内学会発表のための旅費に使用する。

  • Research Products

    (22 results)

All 2013 2012

All Journal Article (10 results) (of which Peer Reviewed: 7 results) Presentation (11 results) Book (1 results)

  • [Journal Article] β4 integrin signaling induces expansion of prostate tumor progenitors.2013

    • Author(s)
      Yoshioka, T., Otero, J., Chen, Y., Kim, Y.M., Koutcher, J.A., Satagopan, J., Reuter, V., Carver, B., de Stanchina, E., Enomoto, K., Greenberg, N.M., Scardino, P.T., Scher, H.I. et al.
    • Journal Title

      J. Clin. Invest.

      Volume: 123 Pages: 682-699

    • DOI

      10.1172/JCI.160720.

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Tumor necrosis factor-α promotes bile ductular transdifferentiation of mature rat hepatocytes in vitro.2013

    • Author(s)
      Nishikawa, Y., Sone, M., Nagahama, Y., Kumagai, E., Doi, Y., Omori, Y., Yoshioka, T., Tokairin, T., Yoshida, M., Yamamoto, Y., Ito, A., Sugiyama, T. and Enomoto, K.
    • Journal Title

      J. Cell. Biochem.

      Volume: 114 Pages: 831-843

    • DOI

      10.1002/jcb.24424

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] 肝前駆細胞由来胆管上皮と肝外胆管前駆細胞由来胆管上皮の胆道系での接点2013

    • Author(s)
      榎本克彦,山本洋平,鈴木麻弥,吉岡年明,大森泰文,曽根正行,西川祐司
    • Journal Title

      肝胆膵

      Volume: 66 Pages: 613-621

  • [Journal Article] Recovery of mature hepatocytic phenotype following bile ductular transdifferentiation of rat hepatocytes in vitro.2012

    • Author(s)
      Sone, M., Nishikawa, Y., Nagahama, Y., Kumagai, E., Doi, Y., Omori, Y., Yoshioka, T., Tokairin, T., Yoshida, M., Sugiyama, T. and Enomoto, K.
    • Journal Title

      Am. J. Pathol.

      Volume: 181 Pages: 2094-2104

    • DOI

      10.1016/j.ajpath.2012.08.034.

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] MRGD, a MAS-relate G-protein coupled receptor, promotes tumorigenesis and is highly expressed in lung cancer.2012

    • Author(s)
      Nishimura, S., Uno, M., Kaneta, Y., Fukuchi, K., Nishigohri, H., Hasegawa, J., Komori, H., Takeda, S., Enomoto, K., Nara, F. and Agatsuma, T.
    • Journal Title

      PLos One

      Volume: 7 Pages: e38618

    • DOI

      10.1371/journal.pone.0038618.

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] The gap junction channel protein connexin 43 is covalently modified and regulated by SUMOylation.2012

    • Author(s)
      Kjenseth, A., Fykerud, T.A., Sirnes, S., Bruun, J., Yohannes, Z., Kolberg, M., Omori, Y., Rivedal, E. and Leithe, E.
    • Journal Title

      J. Biol. Chem.

      Volume: 287 Pages: 15851-15861

    • DOI

      10.1074/jbc.M111.281832

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Smad ubiquitination regulatory factor-2 controls gap junction intercellular communication by modulating endocytosis and degradation of connexin43.2012

    • Author(s)
      Fykerud, T.A., Kjenseth, A., Schink, K.O., Sirnes, S., Bruun, J., Omori, Y., Brech, A., Rivedal, E. and Leithe, E.
    • Journal Title

      J. Cell Sci.

      Volume: 125 Pages: 3966-3976

    • DOI

      10.1242/jcs.093500.

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Effective use of gemcitabine in the treatment of undifferentiated carcinoma with osteoclast-like giant cells of the pancreas with portal vein tumor thrombus.2012

    • Author(s)
      Yoshioka, M., Uchinami, H., Watanabe, G., Takahashi, T., Nakagawa, Y., Andoh, H., Yoshioka, T., Nanjo, H. and Yamamoto, Y.
    • Journal Title

      Intern. Med.

      Volume: 51 Pages: 2145-2150

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] 肝再生と類洞内皮細胞2012

    • Author(s)
      榎本克彦,山本洋平,吉岡年明,大森泰文,西川祐司
    • Journal Title

      生化学

      Volume: 84 Pages: 642-648

  • [Journal Article] 肝細胞と胆管上皮の相互可塑性2012

    • Author(s)
      西川祐司,永濱康晴,曽根正行,山本雅大,榎本克彦
    • Journal Title

      生化学

      Volume: 84 Pages: 649-657

  • [Presentation] ゴルジ体に局在するコネキシン32により活性化する小胞体ストレス防護的応答の癌幹細胞における役割2013

    • Author(s)
      大森泰文, 吉岡年明, 山本洋平, 榎本克彦
    • Organizer
      第102回日本病理学会総会
    • Place of Presentation
      札幌市
    • Year and Date
      20130606-20130608
  • [Presentation] 頭頸部癌細胞におけるconnexin26の局在の変化の影響2013

    • Author(s)
      飯川延子,大森泰文,本田耕平,榎本克彦,石川和夫
    • Organizer
      第114回日本耳鼻咽喉科学会総会・学術講演会
    • Place of Presentation
      札幌市
    • Year and Date
      20130515-20130518
  • [Presentation] 肝癌幹細胞とゴルジ・ERストレス応答2012

    • Author(s)
      榎本克彦
    • Organizer
      第17回日本肝臓医生物学研究会
    • Place of Presentation
      旭川市
    • Year and Date
      20121020-20121020
  • [Presentation] [Morning Lectures] Liver cancer stem cell and stress response.2012

    • Author(s)
      Enomoto, K.
    • Organizer
      第71回日本癌学会総会
    • Place of Presentation
      札幌市
    • Year and Date
      20120919-20120921
  • [Presentation] [Symposium] Recto-verso of connexin in cancer development and progression.2012

    • Author(s)
      Omori, Y.
    • Organizer
      第71回日本癌学会総会
    • Place of Presentation
      札幌市
    • Year and Date
      20120919-20120921
  • [Presentation] Study of expression of heregulin in the human liver metastasis.2012

    • Author(s)
      Yoshioka, T., Nishikawa, Y., Yamamoto, Y., Omori, Y., Nanjo, H. and Enomoto, K.
    • Organizer
      第71回日本癌学会総会
    • Place of Presentation
      札幌市
    • Year and Date
      20120919-20120921
  • [Presentation] Characterization of microRNAs in exosomes derived from human gallbladder carcinoma cell lines.2012

    • Author(s)
      Yamamoto, Y., Omori, Y., Yoshioka, T. and Enomoto, K.
    • Organizer
      第71回日本癌学会総会
    • Place of Presentation
      札幌市
    • Year and Date
      20120919-20120921
  • [Presentation] Mature mouse hepatocytes can transdifferentiate into bile ductular cells in vivo.2012

    • Author(s)
      Nishikawa, Y., Nagahama, Y., Chen, X., Yamamoto, M. and Enomoto, K.
    • Organizer
      第71回日本癌学会総会
    • Place of Presentation
      札幌市
    • Year and Date
      20120919-20120921
  • [Presentation] コネキシン32のゴルジ体内貯留による癌幹細胞自己複製亢進はゴルジ-小胞体ストレス応答経路を介する2012

    • Author(s)
      大森泰文,吉岡年明,山本洋平,榎本克彦
    • Organizer
      第101回日本病理学会総会
    • Place of Presentation
      東京都
    • Year and Date
      20120426-20120428
  • [Presentation] ラット傷害肝および部分肝切除における肝細胞でのheregulin発現の検討2012

    • Author(s)
      吉岡年明,西川祐司,山本洋平,大森泰文,南條 博,榎本克彦
    • Organizer
      第101回日本病理学会総会
    • Place of Presentation
      東京都
    • Year and Date
      20120426-20120428
  • [Presentation] マウス成熟肝細胞はin vitroおよびin vivoにおいて細胆管上皮へと分化転換しうる2012

    • Author(s)
      永濱康晴,曽根正行,陳錫,岡田陽子,辛氷,山本雅大,榎本克彦,西川祐司
    • Organizer
      第101回日本病理学会総会
    • Place of Presentation
      東京都
    • Year and Date
      20120426-20120428
  • [Book] Hepatocellular Carcinoma - Basic Research2012

    • Author(s)
      Omori, Y., Kawasaki, Y., Li, Q., Yoshioka, T., Yamamoto, Y. and Enomoto, K.
    • Total Pages
      402
    • Publisher
      InTech

URL: 

Published: 2014-07-24  

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