2012 Fiscal Year Research-status Report
αシヌクレインの選択的オートファジー分解におけるＢＡＧ３／ＨＳＰ７０複合体の役割
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24591272
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Kyoto Prefectural University of Medicine |
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Principal Investigator |
渡邊 義久 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (50363990)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田中 雅樹 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (80264753)
徳田 隆彦 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (80242692)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | パーキンソン病 / α-シヌクレイン / オートファジー / BAG3 |
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| Research Abstract |
in vitroで作製したα-シヌクレイン fibrilをLipofectamine試薬を用いて培養細胞HEK293へ導入した。導入されたfibrilは細胞内でアダプター蛋白質p62/SQSTM1依存的にオートファジーにより分解されることを明らかにした。そして、Atg-5のsiRNA導入によるオートファジー抑制により、導入したfibrilの蓄積は増加し、ラパマイシン処理によるオートファジー活性化はFibrilの分解を促進することを見出した。
次に、選択的オートファジー分解に関与するBAG3蛋白質のα-シヌクレイン凝集体へ局在を確かめた。そのために、α-シヌクレイン-ECFP融合蛋白質（αSyn-ECFP）の安定発現HEK293細胞を作製した。この細胞にα-シヌクレイン fibrilを導入し、これをSeedとなりαSyn-ECFPが細胞内で凝集することを確認した。このような細胞モデルを使用し、BAG3蛋白質の局在を免疫細胞化学法により解析を行った。この解析を行う前に、購入した抗BAG3抗体の特異性をチェックするために、BAG3発現プラスミドを作製・ウェスタンブロットおよび免疫染色を行い、この抗体の特異性を確認した。この抗BAG3および抗HSP70抗体を使用し、Seed導入によるαSyn-ECFP封入体形成細胞の免疫染色を行った。その結果、封入体にBAG3およびHSP70が共存していることを培養細胞モデルで確かめた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度はα-シヌクレイン fibrilのオートファジーによる分解機構を明らかにすることができ、この研究成果は学術誌に発表した（Watanabe et al. p62/SQSTM1-dependent autophagy of Lewy body-like α-synuclein inclusions. PLoS One. 2012;7(12):e52868）。そして、α-シヌクレイン封入体とBAG3蛋白質の共存についても、培養細胞モデルで明らかにすることができた。また、今後の解析に使用するBAG3発現ベクターの構築やα-シヌクレイン封入体形成のin vivoモデルの作製準備なども行うことができ、順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度は、α-シヌクレイン封入体形成のin vivoモデルを用い、マウス脳内封入体へのBAG3の局在性を免疫組織化学法により検討する。さらにこの検討ができたら、パーキンソン病や多系統萎縮症などのシヌクレイノパチーの封入体へのBAG3蛋白質の存在を調べる。
次に、α-シヌクレイン分解におけるBAG3の関与について分子生物学的解析で検討する。まず、BAG3ノックダウンによるα-シヌクレイン分解への影響を調べる。さらに、α-シヌクレインとBAG3/HSP70複合体との結合をin vitroで検証を行う。そのために、6xHisタグを連結したBAG3の大腸菌発現プラスミドを構築し、組換え蛋白質をニッケルカラムを用い精製する。そして、このBAG3と精製HSP70蛋白質をα-シヌクレインに加え、その結合を免疫沈降法で解析する。また、BAG3のどのドメインが必要であるかを解析するために、各ドメインを欠失させた組換えBAG3も作製し、同様に結合実験を行う。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
H25年度は、分子生物解析に300千円、生化学解析に200千円、細胞・組織の免疫染色に400千円を計上する。また、学会発表および情報収集のための出張旅費として300千円を計上する。
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[Presentation] Autophagic clearance of Lewy body-like α-synuclein inclusions.2013
Author(s)
Taguchi, K., Watanabe, Y., Tatebe, H., Endo, Y., Tokuda, T., Mizuno, T., Nakagawa, M., Tanaka, M.
Organizer
11th International Conference On Alzheimer's & Parkinson's Diseases 2013
Place of Presentation
Florence, Italy
Year and Date
20130306-20130310
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[Presentation] p62/SQSTM1-dependent autophagic clearance of Lewy body-like α-synuclein inclusions.2012
Author(s)
Watanabe, Y., Tatebe, H., Taguchi, K., Endo, Y., Tokuda, T., Mizuno, T., Nakagawa, M., Tanaka, M.
Organizer
42th annual meeting of the Society for Neuroscience 2012
Place of Presentation
New Orleans, USA
Year and Date
20121013-20121017
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[Presentation] p62/SQSTM1-dependent autophagy of Lewy body-like α-synuclein inclusions.2012
Author(s)
Watanabe, Y., Tatebe, H., Taguchi, K., Endo, Y., Tokuda, T., Mizuno, T., Nakagawa, M., Tanaka, M.
Organizer
14th International Congress of Histochemistry and Cytochemistry
Place of Presentation
Kyoto, Japan
Year and Date
20120826-20120829
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