2012 Fiscal Year Research-status Report

ｉｎ　ｖｉｔｒｏ膵発癌モデルの確立と発癌メカニズムの解明

Research Project

Project/Area Number	24592042
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Research Institution	Osaka Medical College
Principal Investigator	宮本好晴大阪医科大学, 医学部, 講師 (20368096)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	内山和久大阪医科大学, 医学部, 教授 (80232867) 林道廣大阪医科大学, 医学部, 講師 (90314179) 田中覚大阪医科大学, 医学部, 助教 (50595741)
Project Period (FY)	2012-04-01 – 2015-03-31
Keywords	膵発癌モデル / in vitro
Research Abstract	膵臓癌は極めて予後不良な癌である。これまで集学的治療にもかかわらず、根治性の高い治療法はいまだ確立されていない。近年分子標的薬が注目され、癌種によっては良好な成績をあげつつあるが、残念ながら膵癌においてその有効性は十分でない。根治性を高めるためには、新規薬剤の開発と早期診断マーカーの発見が急務である。前癌前駆病変から膵臓癌へ移行する分子機構の詳細な解明は、分子標的薬の開発および早期診断マーカー探索の上で非常に重要である。本研究ではin vitroにおける膵発癌モデルを開発しその分子機構を解明する。クリーンベンチで、BALB/cCr Slcマウスから膵を摘出し腺房細胞を分離し24-wellのdishを用いコラーゲンゲル中で3次元培養する。1日おきにTGF-α（50μM）を投与して、acinar-to-ductal metaplasiaを観察したが、ductへ変化する細胞の割合が低く、また一定しなかった。繰り返し腺房細胞の分離を行ったが、ductへ変化する割合は低いままであった。TGF-αなどの試薬類の交換や各ステップで逐一チェックを行い、変化率を向上させるのに予想以上に時間を費やした。プロトコルのマイナーチェンジを行い、また手技的な向上もありようやく一定の変化率を得るようになった。現在Day 7でコラーゲンゲルをcollagenaseにて分解し、ductal cellを通常のplastic dishで培養しPile upの有無を検討中である。今後は、Day0,1,3,5,7,14のTGF-α induced acinar-to-ductal metaplasiaからのmRNA・蛋白抽出を抽出しcDNAを作成し、Neoplasm形質獲得の有無を検討する予定である。さらにp16、p53、Smad4を標的としたsiRNAを作成し細胞内に導入し、形質の変化をみる。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 4: Progress in research has been delayed. Reason クリーンベンチの修繕や研究室内の整理に時間を要したことや、臨床におけるルーチーンワークと研究時間の兼ね合いがうまくいかず、コンスタントに実験ができなかったことが最大の理由であると考えられる。
Strategy for Future Research Activity	siRNAによる標的mRNAのknockdownモデルを作成する。p16、p53、Smad4を標的としたsiRNAをWeb上で標的mRNAの配列を検索し、oligo DNA、pBAsiベクターをデザインし外注する。シークエンスを確認後、トランスフェクションする。リアルタイムPCRで標的mRNAの発現低下を確認するとともに、neoplasm形質の獲得の有無を検討する。knockdownする順番、時期、個数（double knockdownやtriple knockdown）は網羅的に検討する予定である。neoplasm形質を獲得した場合は、各種の阻害剤を用いた増殖抑制実験を行う。EGFR経路、RAS-MAPK経路、PI3-AKT-mTOR経路、Hedgehog経路に焦点をあて、各経路の阻害剤（EGFレセプター阻害剤：AG1478、PI3リン酸経路阻害剤：LY294002、Rasレセプター阻害剤：FTI-277、MAP kinase阻害剤：PD98059、Shh伝達経路阻害剤：IPI-926）を投与し、細胞数（ductal cellの個数）をカウントする。また、各経路のkinase活性や代謝産物の増減をRT-PCRあるいはWestern blotにて検討する。さらに、Exocrine pancreasのprogenitor cellのマーカーであるNestinが一過性に強発現する、Day3、Day 4の前後にacinar to ductal metaplasiaのいわゆるinitiatorが発現している可能性があるため、Day0とDay1, 2, 3, 5から抽出したタンパクをプロテオミクスの手法を用いて比較検討する。
Expenditure Plans for the Next FY Research Funding	各種抗体、阻害剤、ゲルなどの物品に115万円、学会出張などの旅費に15万円、研究会の謝金などに5万円を使用する予定である。また、今年度の研究の遅滞に伴う物品費の残り約60万円を次年度使用する予定である。