核磁気共鳴法と電子スピン共鳴法を用いた全身麻酔薬の作用部位に関する研究

2012 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 24593044
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 渋谷 真希子 北海道大学, 歯学研究科(研究院), 助教 (30399951)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 平沖 敏文 北海道大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (10125346) ; 長谷 由理 北海道大学, 大学病院, 医員 (20626121) ; 藤澤 俊明 北海道大学, 歯学研究科(研究院), 教授 (30190028) ; 鈴木 邦明 北海道大学, 歯学研究科(研究院), 教授 (40133748) ; 木村 幸文 北海道大学, 大学病院, 助教 (00292037)
• Project Period (FY): 2012-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: 全身麻酔薬 / 電子スピン共鳴 / 核磁気共鳴 / スピンラベル

Research Abstract

本研究の目的は、生体モデル膜における脂質あるいはタンパク質と、全身麻酔薬との位置関係や相互作用について検討することにより、全身麻酔薬の細胞膜における作用点や機序を解明することである。そのために、１）生体モデル膜の作成、２）不対電子の情報から得られるESRスペクトルの測定、３）原子核の情報から得られるNMRスペクトルの測定、４）放射活性の測定から得られるイオン輸送の測定、以上の４つの事項を遂行することが必要である。本年度は１），２）を用い、Na,K-ATPaseを組み込んだリポソーム中のスピンラベル剤5-DSA および16-DSA におけるESRスペクトルを検討した。5-DSAか16-DSAのいずれかとNa,K-ATPaseを含んだリポソームのESRスペクトルは、脂質単独のときとほぼ同様であった。また、スペクトル強度は、セボフルレンやイソフルレン、ハロセン、エーテル、エタノール、プロポフォールでは高濃度を加えたときに増大したものの、いずれの麻酔薬を添加しても膜流動性の指標となるSやτにはほとんど影響しなかった。
以上の結果から、今回の作成条件において脂質単独の結果と同様、麻酔薬はタンパクを含んだリポソームの表層にとどまっており、ニトロキシドラジカルの存在する脂質の深い疎水部や比較的浅い親水部付近まで影響を及ぼさないことが示された。したがって、Na,K-ATPaseの存在は膜中でのスピンラベル剤の周囲環境および麻酔薬の作用に影響を及ぼさないことを示唆した。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

ESRを用いた実験に関しては、Na,K-ATPaseを組み込んだリポソーム中のスピンラベル剤5-DSA および16-DSA におけるESRスペクトルを検討し、麻酔薬はタンパクを含んだリポソームの表層にとどまっていること、Na,K-ATPaseの存在は膜中でのスピンラベル剤の周囲環境および麻酔薬の作用に影響を及ぼさないことを示すことができた段階までは概ね順調であった。しかし、次段階として着手したCa-ATPaseを用いた実験にて純粋なCa-ATPaseを抽出することに時間を要しており、タンパク質抽出法の更なる検討が必要となっていることから、当初の計画に比べてやや遅れていると評価した。
それに伴い、NMRスペクトル測定を用いた実験系は平成２５年度以降にまとめて行うよう実験計画を変更し、対応することとしたため、総括すると実験計画は遅れている状態である。

Strategy for Future Research Activity

昨年度に着手できなかったNMRを用いた実験系を優先して行うことにより、実験系の遅れを挽回することとする。すなわち、タンパク質を含まないリポソーム、およびNa,K-ATPaseを含むリポソームにフッ素を含む麻酔薬としてイソフルランを加え、19F-NMR測定を行うことにより、麻酔薬の存在部位の検討を行う。それと同時に、GABAAやアセチルコリン、NMDAといった各受容体を抽出したうえで、それらを含んだリポソーム作成を進め、Na,K-ATPaseを含むリポソームと同様の手法によりESR測定およびNMR測定を行う。
Ca-ATPaseの抽出方法に関しては、文献による検索を行うと同時に、他の生物学の研究者からの情報を収集することや、学術大会に出席することにより知見を得ることを検討する。
さらに、実験結果を広く知らしめるため、NMR測定の結果が出揃い次第、早期に学会発表および論文発表を行うよう検討する。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

試薬を発注したが業者側の欠品にて納入が間に合わなかったため使用できなかった。２５年度において、注文試薬の購入に使用する予定である。