歯周病細菌性因子の解明を目指したプラーク由来臨床株の分離とそのゲノム解析

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 24593135
• Research Institution: Aichi Gakuin University
• Principal Investigator: 林 潤一郎 愛知学院大学, 歯学部, 講師 (30350937)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 石原 裕一 愛知学院大学, 歯学部, 准教授 (50261011) ; 亀井 英彦 愛知学院大学, 歯学部, 講師 (50421243) ; 森田 英利 麻布大学, 獣医学部, 教授 (70257294)
• Keywords: 歯周病 / プラーク細菌 / 16SrRNA解析

Research Abstract

本研究は、歯周病をはじめとする口腔の疾患に対し、デンタルプラーク（以下プラーク）中の細菌が大きく影響していることから、７００種以上と言われる複雑な口腔細菌叢のデータベース構築の際のリファレンス情報の充実を念頭におき、未分離の新菌種候補を新たに生菌分離し、その性状を解析しようとするものである。平成２４年度は、歯周病患者よりプラークを採取し、生菌の分離を行ったところ、60株の分離株を得た。これらの株について、１６SリボソームRNA遺伝子配列の決定による系統解析を行った。既知の菌株との相同性が98.7％以下のもの、配列の登録はあるが、菌種の特定ができていないものとの相同性が高いものについて、それらを新菌種候補として検討を行ったところ、１７株が該当した。平成２５年度は、前年度に引き続き歯周病患者よりプラークのサンプリングを行った。新たに５名の患者よりプラークを採取し、２０％グリセロールにて凍結保存した。順次分離作業を進める。前年度に分離した１７株の内、3株については、特に相同性が低く、新菌種である可能性が高いため、再度１６S遺伝子のシークエンスを行い、より正確な塩基配列を調査した。また、これらの生物学的性状についての検討を開始した。さらに、これらの株は、全ゲノムのドラフトシークエンスを実施する予定であったが、２５年度中に開始することはできなかった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

２４年度は、サンプリングした被験者の数は少なかったものの、採取したサンプルから17株の新菌種候補を得ることができ、順調に経過していた。２５年度に入り、１７株の中でも、特に既知の菌種と相同性の低い３株を選び、より詳細な１６S遺伝子のシークエンスを行った。それらの分離株について、性状試験やDNA-DNAハイブリダイゼーション等により、細菌学的な特徴についての検討を開始したが、それらの解析についての作業について遅延が生じており、解析可能な結果には至っていない。また、全ゲノムのドラフトシークエンスについても、開始しておらず、これまでの研究の達成度としては、やや遅れていると考える。

Strategy for Future Research Activity

２５年度中に得たサンプルからも、同様に生菌分離を行う予定です。既知の菌種と特に相同性の低かった３株については、性状分析を進め、生物学的な特徴を明らかにするとともに、全ゲノムのドラフトシークエンスを実施する予定である。ドラフトシークエンスは、パイロシークエンス法を応用した次世代シークエンサーを用いてショットガン方式にて行う予定である。全ゲノムの詳細なシークエンスの決定は困難であるため、可能な限りのアッセンブリを行う。得られたデータは公的データベースに登録し、リファレンス情報として利用できるようにする予定である。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

25年度の計画として、新種候補株が得られた場合にドラフトゲノムシークエンスを実施する予定であったが、実施施設の稼働状況から年度内に実施されなかったため。
最終年度となる26年度には、ドラフトシークエンスを行い新菌種を提唱する予定であり、その為の費用として、前年度からの繰り越し分と合わせて研究費の使用を行う。