2014 Fiscal Year Research-status Report
ビタミンＥ類化合物のアノイキス誘導機構の解明と肝硬変薬物療法への応用
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24614003
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| Research Institution | Akita University |
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Principal Investigator |
山口 典子 秋田大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (90251553)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
吉川 究 秋田大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (90400481)
目崎 喜弘 秋田大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (40431621)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 肝臓星細胞 / 肝線維症 / ビタミンＥ / トコール / アノイキス / コラーゲン / MMP |
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| Outline of Annual Research Achievements |
肝臓星細胞 (HSC) は肝炎などの病態において活性化され、筋線維芽細胞様に分化形質転換してコラーゲンなどの線維性細胞外マトリックス産生が亢進することから、肝硬変の治療において標的細胞と考えられている。また、近年発症率が増加している、肥満に伴う非アルコール性脂肪性肝炎 (NASH) の原因として、HSCが細胞老化に陥り炎症や発がんを促進する物質を分泌していることが明らかにされている。従ってNASH肝癌発症においてもHSC関与の重要性が指摘されている。
HSCを治療における標的細胞と考えた場合、活性化HSCに対してアポトーシス誘導、不活性化状態への回帰、再分化によるHSC誘導などが考案されているが、私達のグループは、ビタミンＥの一種であるδ―トコフェロールと類縁化合物であるトコールが活性化HSCに対してアポトーシスを誘導することを明らかにし、特にトコールは接着細胞が基質から脱着することを契機とするアノイキス誘導能を示すことから、治療薬としての将来性を視野に作用機序の解明を進めてきた。
アノイキス誘導にプロテアーゼの関与を推定し、種々のインヒビターを用いて検討したところ、細胞内での分解にはリソソーム、プロテアソームの関与が示され、焦点接着装置の分解に寄与していること、またメタロプロテアーゼは細胞外基質の分解に関与していると考えられた。さらに発現変動遺伝子を網羅的に解析したところ、線維形成コラーゲン (I型、III型)の発現低下、基底膜構成成分の発現低下、細胞外マトリックス分解酵素 (MMP、ADAM) の発現増加、その内因性阻害因子 (TIMP) の発現低下が明らかにされた。結果確認のため、MMP siRNAを用いたノックダウンによるアノイキス誘導阻害を検討し、高分子であるコラーゲンは強制発現が難しいことから、コラーゲンや基底膜ゲルをコートして細胞脱着に対する影響を検討した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
[トコールによるアノイキス誘導機構の解析]
コラーゲンコートによる細胞脱着阻害は数種の市販I型コラーゲンを検討することにより、有意な阻害が観察され、線維性コラーゲンの分解が細胞脱着の契機となることが示された。線維性コラーゲンを分解するMMPの発現をノックアウトするため、デザインされたsiRNAを購入したが、導入を始めとする実験条件の最適化に時間を要した。また、MMPを分泌タンパク質として同定し、半定量を行うための有用な抗体の選定にも時間を要した。
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| Strategy for Future Research Activity |
[トコールによるアノイキス誘導機構の解析]
トコールの作用により発現変動が顕著なMMP-13 (齧歯類におけるコラゲナーゼ) とI型コラーゲンα１、α２鎖のプロモーター領域をPCR法により調製する。ルシフェラーゼ遺伝子を用いてリポーターコンストラクトを作成し、転写調節を確認する。さらにトコールの各々の遺伝子における応答配列を決定し、比較する。線維芽細胞などではコラーゲンの発現とMMPの発現は協調することが観察されているにも関わらず、HSCにおいてトコールが発現変動を分解系にシフトさせている要因は何か、既知の発現調節物質に対する応答配列との比較や関与する転写因子などから明らかにしていく。
[肝線維症、肝癌におけるトコールの有効性の検討]
幼年マウス（生後数日）にストレプトゾトシン投与を行い、離乳から高脂肪食の負荷を開始する方法で、肝線維症モデルマウスを作成する。また、同様に幼年マウス（生後数日）の背中に化学発がん物質を塗布し、その後高脂肪食を負荷させて肝癌を発症させるモデルマウスを作成する。両モデルマウスにおいて線維化の進行抑制と肝線維症寛解、並びに肝癌の抑制に対するトコールの有効性を検討する。
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| Causes of Carryover |
前年度未使用額が発生した理由は、計画していた海外での学会発表が出来なかったこと、さらに科研費の使用期限後３月末に国内学会の旅費に使用する予定であったことによる。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
前年度の未使用額は３月末の国内学会旅費、海外学会への旅費、論文作成費用に使用する計画である。
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