シックハウス症候群に対する高感度プローブとしてのＤＮＡ付加体損傷の解析

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 24655143
• Research Institution: Saga University
• Principal Investigator: 近藤 敏弘 佐賀大学, 総合分析実験センター, 教務員 (20186852)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 寺東 宏明 佐賀大学, 総合分析実験センター, 准教授 (00243543) ; 徳山 由佳 佐賀大学, 総合分析実験センター, 教務員 (30398135) ; 市場 正良 佐賀大学, 医学部, 教授 (60184628)
• Keywords: 核酸関連化学 / シックハウス症候群 / 質量分析

Research Abstract

シックハウス症候群の主要原因物質であるホルムアルデヒドにばく露された個体ならびに細胞のヌクレオチドプール中に生じるDNA付加体損傷の分析方法を検討した。具体的には、文献（Nucl. Acids Res. (2010) 38 (12):3975-3983.）に記載の方法に準じ、標準dNTPsを用いて高速液体クロマトグラフィー（HPLC）によるヌクレオチド分離条件の検討を行った。さらに、ホルムアルデヒドによるdNTPとアミノ酸の試験管内反応実験を行い、dNTP-アミノ酸付加体のシグナルを検出した。現在、このシグナルピークの質量分析を行なっている。また、標準dNTPsを用いて高速液体クロマトグラフィー質量分析計（LC/MS）によるヌクレオチド分離条件の検討を行い4種類の標準dNTPsの分離を確認した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

平成25年度は暴露細胞のDNA付加体損傷生成に関与するペプチド・タンパク因子の同定をプロテオミクス的解析手法により行う計画を変更した。具合的にはホルムアルデヒドガス暴露した培養細胞から染色体DNA画分を単離し、ヌクレアーゼ処理によりDNAを分解・除去し、付加体ペプチド／タンパク質構成成分を精製後、ペプチド／タンパク質混合物を二次元電気泳動で分離、各スポットを質量分析にかけ、付加体形成に関わるペプチド・タンパク質因子を同定する計画であったが、ホルムアルデヒドとDNA-タンパク付加体,dNTPヌクレオチドプールをバイオマーカーとしてDNA付加体損傷の解析を行う計画へ変更した。
平成２５年度はdNTP付加体損傷のHPLC分離条件を確立した。また、標準dNTPsを用いて高速液体クロマトグラフィー質量分析計（LC/MS）によるヌクレオチド分離条件の検討を行い4種類の標準dNTPsの分離を確認した。平成２５年度はホルムアルデヒドによるdNTPとアミノ酸の試験管内反応実験を行い、dNTP-アミノ酸付加体のシグナルを検出し、付加体生成を明確にする予定であった。現在、このシグナルピークの質量分析を行なっている。その一方でホルムアルデヒドばく露培養細胞からヌクレオチドプールを抽出し、その中のdNTP付加体を検出、分析する段階までに到達しなかったため。

Strategy for Future Research Activity

今後は、まず試験管内反応によるdNTP付加体分析を行い、次にホルムアルデヒドばく露培養細胞からヌクレオチドプールを抽出し、その中のdNTP付加体を検出、分析する。最後に、ホルムアルデヒドばく露マウス個体試料からdNTP付加体を検出、分析し、dNTP付加体生成量を指標としたホルムアルデヒドばく露評価系の確立を目指す。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

HPLCならびに質量分析に予想以上に時間を費やしたために、培養細胞を用いたホルムアルデヒドばく露実験を行う細胞培養実験に到達しなかったため。
主として、培養細胞を用いたホルムアルデヒドばく露実験を行うことから、細胞培養関連試薬等に使用するとともに、HPLCならびに質量分析関連試薬にも引き続き使用する予定である。