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2013 Fiscal Year Research-status Report

人工酵素ZFNを用いたユニバーサル遺伝子改変システムの開発

Research Project

Project/Area Number 24657156
Research InstitutionHiroshima University

Principal Investigator

山本 卓  広島大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (90244102)

Keywordsバイオテクノロジー / ゲノム編集
Research Abstract

平成25年度は以下の研究を行った。
1)人工ヌクレアーゼとしてTALENシステムを導入し、その効率的作製方法を確立した。この方法を用いて作製したTALENを利用して、線虫、ショウジョウバエ、ウニ、ホヤ、カエル、イモリ、マウス、ラットにおける標的遺伝子破壊を成功させた。これらの成果をまとめ、日本発生生物学会の機関誌へ投稿し、ゲノム編集の特集号に掲載された。
2)哺乳類でのゲノム編集の効率化を図るために、高活性型のTALEN(Platinum TALEN)の開発を行なった。このTALENを用いることによって、従来変異導入効率が低かった哺乳類において高頻度に変異導入ができることを示した。
3)カエルにおいて、2組のPlatinum TALENを用いて、2つの遺伝子を同時に破壊することに成功した。
4)第3世代のゲノム編集ツールであるCRISPR/Cas9システムを利用して、培養細胞およびマウスでの遺伝子破壊を試みた。培養細胞では複数のガイドRNAを発現するベクターシステムを確立し、1つのベクターをトランスフェクションするだけで複数の遺伝子を破壊できることを示した。
5)ゲノム編集によって目的の遺伝子へレポーター遺伝子を挿入する方法を確立した。TALENによってTyr遺伝子を切断し、そこへCMVプロモーターでドライブされるGFP遺伝子を挿入し、アルビノにする一方でGFP蛍光を発するカエル胚の作製に成功した。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

人工ヌクレアーゼとしてZFNからTALENに変えることによって、作製効率が大幅に上昇した。その結果、様々な動物(ウニ、ホヤ、カエル、マウス、ラットなど)での遺伝子破壊の成功例を示すことができた。さらに、本年度開発した高活性型TALEN(Platinum TALEN)は、様々な動物での遺伝子破壊を実現するシステムとして内外から高く評価された。

Strategy for Future Research Activity

遺伝子破壊に加えて、標的遺伝子へのノックインシステムを確立する。成功例は出ているものの、ノックイン効率は未だ低い状況であるので、来年度はノックインの効率化を目指す。

  • Research Products

    (18 results)

All 2014 2013 Other

All Journal Article (10 results) (of which Peer Reviewed: 10 results) Presentation (5 results) (of which Invited: 5 results) Remarks (2 results) Patent(Industrial Property Rights) (1 results)

  • [Journal Article] TALEN-induced gene knock out in Drosophila.2014

    • Author(s)
      Kondo T, Sakuma T, Wada H, Akimoto A, Yamamoto T and Hayashi S
    • Journal Title

      Dev Growth Differ

      Volume: 56 Pages: 86-91

    • DOI

      10.1111/dgd.12097

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] TALENs efficiently disrupt the target gene in Iberian ribbed newts (Pleurodeles waltl), an experimental model animal for regeneration.2014

    • Author(s)
      Hayashi T, Sakamoto K, Sakuma T, Yokotani N, Inoue T, Kawaguchi E, Agata K, Yamamoto T and Takeuchi T
    • Journal Title

      Dev Growth Differ

      Volume: 56 Pages: 115-121

    • DOI

      10.1111/dgd.12103

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Targeted mutagenesis in sea urchin embryos using TALENs.2014

    • Author(s)
      Hosoi S, Sakuma T, Sakamoto N and Yamamoto T
    • Journal Title

      Dev Growth Differ

      Volume: 56 Pages: 92-97

    • DOI

      10.1111/dgd.12099

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Targeted mutagenesis of multiple and paralogous genes in Xenopus laevis using two pairs of TALENs.2014

    • Author(s)
      Sakane Y, Sakuma T, Kashiwagi K,Kashiwagi A, Yamamoto T and Suzuki K
    • Journal Title

      Dev Growth Differ

      Volume: 56 Pages: 108-114

    • DOI

      10.1111/dgd.12105

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Versatile strategy for isolating TALEN-mediated knockout mutants in Caenorhabditis elegans.2014

    • Author(s)
      Sugi T, Sakuma T, Ohtani T and Yamamoto T
    • Journal Title

      Dev Growth Differ

      Volume: 56 Pages: 78-85

    • DOI

      10.1111/dgd.12108

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Tissue-specific and ubiquitous gene knockouts in Ciona by electroporating TALENs provide new approaches to investigate gene functions2014

    • Author(s)
      Treen N, Yoshida K, Sakuma T, Sasaki H, Kawai N, Yamamoto T and Sasakura Y
    • Journal Title

      Development

      Volume: 141 Pages: 481-487

    • DOI

      10.1242/dev.099572

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] TALEN-mediated single-base-pair editing identification of an intergenic mutation upstream of BUB1B as causative of PCS (MVA) syndrome2014

    • Author(s)
      Ochiai H, Miyamoto T, Kanai A, Hosoba K, Sakuma T, Kudo Y, Asami K, Ogawa A, Watanabe A, Kajii T, Yamamoto T and Matsuura S
    • Journal Title

      Proc Natl Acad Sci U S A

      Volume: 111 Pages: 1461-1466

    • DOI

      10.1073/pnas.1317008111

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Efficient TALEN construction and evaluation methods for human cell and animal applications.2013

    • Author(s)
      Sakuma T, Hosoi S, Woltjen K, Suzuki KI, Kashiwagi K, Wada H, Ochiai H, Miyamoto T, Kawai N, Sasakura Y, Matsuura S, Okada Y, Kawahara A, Hayashi S and Yamamoto T
    • Journal Title

      Gene Cells

      Volume: 18 Pages: 315-326

    • DOI

      10.1111/gtc.12037

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] roduction of Sry knockout mouse using TALEN via oocyte injection.2013

    • Author(s)
      Kato T, Miyata K, Sonobe M, Yamashita S, Tamano M, Miura K, Kanai Y, Miyamoto S, Sakuma T, Yamamoto T, Inui M, Kikusui T, Asahara H, Takada S
    • Journal Title

      Sci Rep

      Volume: 3 Pages: 3136

    • DOI

      10.1038/srep03136

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Repeating pattern of non-RVD variations in DNA-binding modules enhances TALEN activity.2013

    • Author(s)
      Sakuma T, Ochiai H, Kaneko T, Mashimo T, Tokumasu D, Sakane Y, Suzuki K, Miyamoto T, Sakamoto N, Matsuura S and Yamamoto T
    • Journal Title

      Sci Rep

      Volume: 3 Pages: 3379

    • DOI

      10.1038/srep03379

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] Platinum TALENの開発と様々な動物におけるゲノム編集

    • Author(s)
      山本卓
    • Organizer
      理研シンポジウム「ゲノムデザイン技術と疾患モデル研究」
    • Place of Presentation
      つくば
    • Invited
  • [Presentation] 人工ヌクレアーゼを用いた両生類でのゲノム編集

    • Author(s)
      山本卓
    • Organizer
      日本動物学会第84回大会シンポジウム「生物実験材料としてのネッタイツメガエルの長所と有用性」
    • Place of Presentation
      岡山
    • Invited
  • [Presentation] 高活性型TALENの開発と哺乳類培養細胞および動物での標的遺伝子改変

    • Author(s)
      山本卓
    • Organizer
      第65回日本生物工学会シンポジウム「次世代の植物バイオテクノロジー」
    • Place of Presentation
      広島
    • Invited
  • [Presentation] ゲノム編集革命ー人工ヌクレアーゼを利用した遺伝子改変技術の開発

    • Author(s)
      山本卓
    • Organizer
      平成25年度広島バイオフォーラム「ここまで進んだゲノム科学とその活用」
    • Place of Presentation
      広島
    • Invited
  • [Presentation] ゲノム編集技術の限りない可能性

    • Author(s)
      山本卓
    • Organizer
      染色体工学研究センター研究成果発表会
    • Place of Presentation
      東京
    • Invited
  • [Remarks] 分子遺伝学研究室

    • URL

      http://www.mls.sci.hiroshima-u.ac.jp/smg/index.html

  • [Remarks] ゲノム編集コンソーシアム

    • URL

      http://www.mls.sci.hiroshima-u.ac.jp/smg/genome_editing/index.html

  • [Patent(Industrial Property Rights)] 核酸挿入用ベクター2013

    • Inventor(s)
      鈴木賢一、坂根祐人、佐久間哲史、山本卓
    • Industrial Property Rights Holder
      鈴木賢一、坂根祐人、佐久間哲史、山本卓
    • Industrial Property Rights Type
      特許
    • Industrial Property Number
      2013-230349
    • Filing Date
      2013-11-06

URL: 

Published: 2015-05-28  

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