2012 Fiscal Year Research-status Report
ＬＡＬファミリー転写制御因子を活性化する小分子化合物による休眠遺伝子覚醒の新戦略
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24658088
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| Research Institution | The Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
高橋 俊二 独立行政法人理化学研究所, 化学情報・化合物創製チーム, チームヘッド (30311608)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2014-03-31
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| Keywords | 休眠遺伝子覚醒 / バイオメディエーター / LALファミリー / 小分子化合物 / 転写制御因子 |
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| Research Abstract |
微生物が作り出す天然化合物は、医薬のシードとして重要であり、抗生物質、抗がん剤、免疫抑制剤など多くの医薬が開発されてきた。近年、新規生理活性化合物の発見が困難となり、大手製薬企業の多くが合成化合物のスクリーニングを行っているが、多様な構造や生理活性を有する微生物代謝物が重要である事に変わりはない。近年のゲノム解析から、有用天然物の探索源である放線菌ゲノム中には30以上の二次代謝生合成遺伝子クラスターが存在するが、一部しか利用されていないことが判明しており、未知の化合物を生産する潜在能力は明らかである。本研究では、放線菌ゲノム中に存在する「休眠遺伝子クラスター」を覚醒する手法を開発し医薬や農薬開発に利用可能な有用生理活性物質を見出すことを目的とする。放線菌(Streptomyces reveromyceticus)を用いて、リベロマイシンA (RM-A)生産増強に関わるバイオメディエーターは、LALファミリー転写制御因子であるrevU遺伝子発現を誘導する。そこで、revU相同遺伝子を含む、放線菌二次代謝生合成遺伝子クラスターを標的として、バイオメディエーター処理を行ったところ、複数の放線菌二次代謝物の生産増強を確認できた。現在、新規化合物と予想される二次代謝産物については、構造決定に向けた精製条件の検討を進めている。また、構造活性相関研究から、放線菌により生産誘導に関わるバイオメディエーター構造は異なる事が判明した。さらに、独自に解析を行ったRM-A生産菌の全ゲノム解読データ、バイオメディエーター処理、未処理のRM-A生産菌より調製したRNAを用いて遺伝子発現の変動を一括解析することにより、全遺伝子の発現解析を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1．バイオメディエーター処理を行うことで複数の放線菌二次代謝物の生産増強に成功した。生産が誘導される新規化合物の精製を進めたが、現在構造決定までには至っていない。ターゲットとしているポリケチド化合物の分子量は1000以上であり、複数の類縁化合物の分離が困難であることから、精製条件検討の検討を進めている。
2．構造活性相関研究によりバイオメディエーター活性に重要な構造を見出した。
3．独自に解析を行ったRM-A生産菌の全ゲノム解読データ、バイオメディエーター処理、未処理のRM-A生産菌より調製したRNAを用いて遺伝子発現の変動を一括解析することにより、全遺伝子の発現解析を進めている。
上記のように実験計画は順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
昨年度に引き続き、未同定の生合成遺伝子クラスターに着目して、バイオメディエーター処理後に生産が誘導される未知化合物の構造を決定するとともに、遺伝子発現解析を広く展開する。LALファミリー転写制御因子により制御されるクラスター以外にもバイオメディエーター処理で発現が変動する遺伝子クラスターが存在するか否かを検証する。
バイオメディエーターを化合物ビーズに固定化し、RM-A生産菌より調整した細胞抽出液と混合して結合タンパク質を探索する。コントロールビーズには結合しないが、バイオメディエーター結合ビーズに特異的に結合するタンパク質を同定する。標的タンパク質が同定出来た場合、特異的な結合を評価する為に、ビーズと結合していないバイオメディエーターを用いて競合実験を行う。また、標的タンパク質を放線菌（Streptomyces lividans TK23）を用いてHis-タグ融合タンパクとして発現・精製を行い、Biacoreを用いてバイオメディエーターとの結合を評価する。さらにタンパク質の大量精製を行い、共結晶構造解析を試みるとともに、より最適な結合様式を有する小分子化合物の探索に向けて、当研究室で開発した化合物アレイを用いて新たな遺伝子覚醒小分子の探索も進める。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
物品費(1,400,000)：培養容器、培地 (200,000)、タンパク質精製試薬、結晶化試薬 、生化学試薬 (400,000)、化合物アレイ,ケミカルビーズ作製試薬 (600,000)、分析カラム、溶媒 (200,000)
旅費(100,000)：学会参加費用:放線菌学会、農芸化学会、生化学会
その他 (100,000)：研究成果発表費用
H24年度未使用発生理由：H25年度の結晶研究を加速させるために、前年度の消耗品費7万を割り当てる。
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