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2012 Fiscal Year Research-status Report

細胞膜ロイシン受容体の提唱とその分子同定およびmTOR系へのリンクの解明

Research Project

Project/Area Number 24659116
Research InstitutionOsaka University

Principal Investigator

金井 好克  大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (60204533)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 大垣 隆一  大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (20467525)
永森 收志  大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (90467572)
Project Period (FY) 2012-04-01 – 2014-03-31
Keywords受容体 / 生体膜 / シグナル情報伝達系 / プロテオミクス
Research Abstract

本研究は、アミノ酸濃度情報をリン酸化シグナルに変換してmTOR系による細胞内代謝調節機構とリンクさせる、細胞膜型ロイシン受容体分子を同定しその機能を明らかにすることを目的としている。これまで当該分野で想定されてきた細胞内アミノ酸センサーとは異なる新しい概念の細胞膜受容体を提唱するものである。
平成24年度は、細胞膜型受容体と細胞内センサーを発現している2種類の細胞株間で、細胞膜タンパク質の網羅的な比較定量プロテオミクス解析を実施した。細胞膜タンパク質をビオチン標識試薬でラベルし、ビオチン-アビジン系を利用したアフィニティー精製により回収した後、トリプシンでペプチド化したサンプルを用いてiTRAQ法により解析した。その結果、細胞膜型受容体を発現している細胞の細胞膜において特に高い発現を示す候補因子をいくつか見出した。現在、得られた候補因子について個別にRNA干渉法によるノックダウンをおこないアミノ酸シグナル系における機能解析を実施している。また並行して、サンプル調製法と質量分析計による測定法の改善にも取り組んだ。細胞膜画分調製に改良を加えて膜貫通型タンパク質に特化した方法を開発し、特に同定が困難とされている複数回膜貫通型タンパク質の同定数を大幅に増やすことに成功した。次年度はこの手法を用いた比較定量プロテオミクス解析を実施して、新たに候補因子の絞り込みをおこなう予定である。さらに、iTRAQ法による比較定量リン酸化プロテオミクス解析を実施して、アミノ酸刺激に応答してリン酸化が上昇する約400種類のタンパク質を見出すことができた。受容体分子の同定後は、この手法により受容体下流の細胞内シグナル伝達系の網羅的な解析に取り組む予定である。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

細胞膜型アミノ酸受容体の分子同定を目的として、細胞膜タンパク質の比較定量プロテオミクスを計画通りに実施し、細胞膜型ロイシン受容体を発現している細胞において特に高発現しているいくつかの因子を見出すことができた。現在、個別にノックダウン実験をおこなってそれら候補因子の機能評価を進めている。その中には、実際にノックダウンによってアミノ酸刺激によるmTORの活性化が抑制される因子も見出されているが、その因子自身は膜タンパク質ではなく足場タンパク質であるため、その結合因子の探索から受容体の同定へつなげるアプローチも検討している。また、ビオチン化ラベルした細胞膜画分を用いたiTRAQ法によるプロテオミクスの実験手技については、細胞質タンパク質も相当数同定される点など依然として改良の余地があったため、膜タンパク質の同定に特化したサンプル調製法と質量分析計による測定法の開発にも並行して取り組んだ。その結果、膜タンパク質の同定数を大幅に伸ばすことにも成功している。今後、この改良した方法を基にさらなる改善を加えながら有望な候補因子の絞り込みを進める。また、当初は次年度に実施を計画していた比較定量リン酸化プロテオミクス解析にも既に着手することができた。細胞内センサーを発現しているHeLaS3細胞をモデルに用いて、細胞内に取り込まれたロイシン刺激依存的な細胞内リン酸化の網羅的変動を明らかにする比較定量リン酸化プロテオミクスの方法論を確立した。一方で、細胞膜型ロイシン受容体に特異的なアゴニストを基にした光反応性プローブの合成には至っておらず、次年度も引き続き取り組んでいく予定である。以上のように、当初の計画とは多少の前後が有るものの、全体としておおむね順調に進展しているものと考える。

Strategy for Future Research Activity

次年度は、以下に述べる手法を並行させて細胞膜型アミノ酸受容体の同定に継続して取り組む。今年度見出した因子の結合因子を質量分析法により網羅的に同定して受容体の単離を試みる他、改良を加えた細胞膜タンパク質の比較定量プロテオミクスによって、受容体候補因子の絞り込みを再度おこなう。また細胞膜型受容体特異的なアゴニストの分子構造を基に光反応性プローブをデザイン・合成し、光ラベル化技術を利用したケミカルバイオロジーの手法による分子同定にも取り組む。このプローブはロイシン受容体と特異的に結合する部分、光ラベルするためのジアジリン環を持つ光活性基部分、ラベルした蛋白質を回収するためのビオチン部分を持つ。この化合物でロイシン受容体を特異的に標識して、質量分析計により蛋白質を同定する。上記の複数の手法により見出した候補因子について、siRNAによる遺伝子ノックダウンを行い、ロイシン添加によって誘導されるmTOR下流のp70S6Kのリン酸化を指標にした機能解析をもって細胞膜ロイシン受容体の分子同定を完了する。
受容体の分子同定後は、比較定量リン酸化プロテオミクスにより細胞膜ロイシン受容体のmTOR系へのリンクを網羅的に明らかにする。細胞膜型ロイシン受容体遺伝子ノックダウン細胞と対照細胞をロイシンで刺激し、iTRAQ法による比較定量リン酸化プロテオミクス解析を実施する。この際、受容体のノックダウンによってロイシン刺激に応答しなくなるものを受容体下流のシグナル経路の候補因子とする。各因子は個別にsiRNAによる遺伝子ノックダウンをおこなって、ロイシンが引き起こすmTOR活性化への影響からその機能的重要性を検証する。さらに、他のmTORシグナル系因子との関連を明らかにするため、細胞膜ロイシン受容体とmTOR系の既知因子との同時ノックダウンを実施する。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

該当なし

  • Research Products

    (33 results)

All 2013 2012 Other

All Journal Article (17 results) (of which Peer Reviewed: 13 results) Presentation (15 results) Book (1 results)

  • [Journal Article] The SLC3 and SLC7 families of amino acid transporters.2013

    • Author(s)
      Fotiadis D, Kanai Y, Palacin M.
    • Journal Title

      Mol Aspects Med.

      Volume: 34 Pages: 139-158

    • DOI

      10.1016/j.mam.2012.10.007.

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] The SLC1 high-affinity glutamate and neutral amino acid transporter family.2013

    • Author(s)
      Kanai Y, Clemencon B, Simonin A, Leuenberger M, Lochner M, Weisstanner M, Hediger MA.
    • Journal Title

      Mol Aspects Med.

      Volume: 34 Pages: 108-120

    • DOI

      10.1016/j.mam.2013.01.001.

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] IUPHAR-DB: updated database content and new features.2013

    • Author(s)
      Sharman JL(以下17名), Kanai Y,(以下8名)
    • Journal Title

      Nucleic Acids Res.

      Volume: 41 Pages: D1083-D1088

    • DOI

      10.1093/nar/gks960

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Mammalian target of rapamycin signalling modulates amino acid uptake by regulating transporter cell surface abundance in primary human trophoblast cells.2013

    • Author(s)
      Rosario FJ, Kanai Y, Powell TL, Jansson T.
    • Journal Title

      J Physiol.

      Volume: 591 Pages: 609-625

    • DOI

      10.1113/jphysiol.2012.238014.

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] L-type amino acid transporter 1 expression is highly correlated with Gleason score in prostate cancer.2013

    • Author(s)
      Segawa A, Nagamori S, Kanai Y, Masawa N, Oyama T.
    • Journal Title

      Mol Clin Onc

      Volume: 1 Pages: 274-280

    • DOI

      10.3892/mco.2012.54

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] The small SLC43 family: facilitator system L amino acid transporters and the orphan EEG1.2013

    • Author(s)
      Bodoy S, Fotiadis D, Stoeger C, Kanai Y, Palacín M.
    • Journal Title

      Mol Aspects Med.

      Volume: Apr;34(2-3) Pages: 638-45

    • DOI

      10.1016/j.mam.2012.12.006. Epub 2012 Dec 23.

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Biological evaluation of 3-[(18)F]fluoro-α-methyl-D-tyrosine (D-[(18)F]FAMT) as a novel amino acid tracer for positron emission tomography.2013

    • Author(s)
      Ohshima Y, Hanaoka H, Tominaga H, Kanai Y, Kaira K, Yamaguchi A, Nagamori S, Oriuchi N, Tsushima Y, Endo K, Ishioka NS.
    • Journal Title

      Ann Nucl Med

      Volume: Jan 23 Pages: in press

    • DOI

      10.1007/s12149-013-0687-7

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Linkage of N-cadherin to multiple cytoskeletal elements revealed by a proteomic approach in hippocampal neurons.2012

    • Author(s)
      Tanaka H, Takafuji K, Taguchi A, Wiriyasermkul P, Ohgaki R, Nagamori S, Suh PG, Kanai Y.
    • Journal Title

      Neurochem Int

      Volume: 61 Pages: 240-250

    • DOI

      10.1016/j.neuint.2012.05.008

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] How to use the IUPHAR receptor database to navigate pharmacological data.2012

    • Author(s)
      Mpamhanga CP,(以下11名), Kanai Y,(以下9名)
    • Journal Title

      Methods Mol Biol.

      Volume: 897 Pages: 15-29

    • DOI

      10.1007/978-1-61779-909-9_2

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Transport of 3-fluoro-L-α-methyl-tyrosine by tumor-upregulated L-type amino acid transporter 1: a cause of the tumor uptake in PET.2012

    • Author(s)
      Wiriyasermkul P, Nagamori S, Tominaga H, Oriuchi N, Kaira K, Nakao H, Kitashoji T, Ohgaki R, Tanaka H, Endou H, Endo K, Sakurai H, Kanai Y.
    • Journal Title

      J Nucl Med.

      Volume: 53 Pages: 1253-1261

    • DOI

      10.2967/jnumed.112.103069

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Prognostic significance of L-type amino-acid transporter 1 expression in surgically resected pancreatic cancer.2012

    • Author(s)
      Kaira K, Sunose Y, Arakawa K, Ogawa T, Sunaga N, Shimizu K, Tominaga H, Oriuchi N, Itoh H, Nagamori S, Kanai Y, Segawa A, Furuya M, Mori M, Oyama T, Takeyoshi I.
    • Journal Title

      Br J Cancer.

      Volume: 107 Pages: 632-638

    • DOI

      10.1038/bjc.2012.310

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Establishment of stable cell lines with high expression of heterodimers of human 4F2hc and human amino acid transporter LAT1 or LAT2 and delineation of their differential interaction with α-alkyl moieties.2012

    • Author(s)
      Khunweeraphong N, Nagamori S, Wiriyasermkul P, Nishinaka Y, Wongthai P, Ohgaki R, Tanaka H, Tominaga H, Sakurai H, Kanai Y.
    • Journal Title

      J Pharmacol Sci.

      Volume: 119 Pages: 368-380

    • DOI

      10.1254/jphs.12124FP

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] NRFL-1, the C. elegans NHERF orthologue, interacts with amino acid transporter 6 (AAT-6) for age-dependent maintenance of AAT-6 on the membrane.2012

    • Author(s)
      Hagiwara K, Nagamori S, Umemura YM, Ohgaki R, Tanaka H, Murata D, Nakagomi S, Nomura KH, Kage-Nakadai E, Mitani S, Nomura K, Kanai Y.
    • Journal Title

      PLoS One.

      Volume: 7 Pages: e43050

    • DOI

      10.1371/journal.pone.0043050

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] アミノ酸トランスポーターを標的とした癌デリバリー.2012

    • Author(s)
      金井好克
    • Journal Title

      Drug Delivery System.

      Volume: 27 Pages: 342-349

  • [Journal Article] アミノ酸トランスポーターとがん代謝2012

    • Author(s)
      金井好克
    • Journal Title

      実験医学

      Volume: 30 Pages: 2494-2500

  • [Journal Article] 悪性腫瘍の診断と治療の分子標的としてのトランスポーター.2012

    • Author(s)
      金井好克
    • Journal Title

      細胞工学

      Volume: 31 Pages: 567-571

  • [Journal Article] 膜輸送系の異常概論2012

    • Author(s)
      金井好克
    • Journal Title

      日本臨床別冊新領域別症候群シリーズ

      Volume: 20 Pages: 759-766

  • [Presentation] Substrate recognition of L-type amino acid transporter 1 provide the understanding of amino acid-mediated cancer cell growth regulation.2013

    • Author(s)
      Pattama Wiriyasermkul, Shushi Nagamori, Naoto Kojima, Yoshikatsu Kanai.
    • Organizer
      Nagoya Symposium; Frontiers in Structural Physiology.
    • Place of Presentation
      Nagoya, Japan.
    • Year and Date
      20130122-20130124
  • [Presentation] アミノ酸トランスポーターLAT1を介したロイシンの取り込みとmTOR系活性化の網羅的解析.2012

    • Author(s)
      永森收志、Pattama Wiriyasermkul、世良田聡、仲哲治、金井好克
    • Organizer
      日本アミノ酸学会第6回学術大会
    • Place of Presentation
      千葉県松戸市
    • Year and Date
      20120928-20120929
  • [Presentation] “Transportsome”, the multi-molecular assemblies for transport-transport and transport-metabolism couplings.

    • Author(s)
      Yoshikatsu Kanai
    • Organizer
      International Symposium on Epithelial Barrier and Transport 2012.
    • Place of Presentation
      Shiga, Japan.
  • [Presentation] Comprehensive variability analysis of nutrients absorption mechanism in small intestine by quantitative proteomics.

    • Author(s)
      Takashi Nishiyama , Shushi Nagamori , Kazuaki Takafuji , Yoshikatsu Kanai.
    • Organizer
      第19回国際質量分析会議.
    • Place of Presentation
      京都市
  • [Presentation] アミノ酸トランスポーターLAT1の発見と新たな分子標的としての意義.

    • Author(s)
      金井 好克
    • Organizer
      がん診療とPETに関するセミナー@佐久総合病院「アミノ酸トランスポーターを標的としたがんのPET診断と治療応用」
    • Place of Presentation
      長野県佐久市
  • [Presentation] Comprehensive phosphoproteomics analysis of cellular responses induced by LAT1-mediated leucine uptake.

    • Author(s)
      Pattama Wiriyasermkul, 永森 收志, 世良田 聡, 仲 哲治, 金井 好克
    • Organizer
      第122回日本薬理学会近畿部会
    • Place of Presentation
      大阪府豊中市
  • [Presentation] Metabolomics and proteomics in transporter research(トランスポーター研究におけるメタボロームとプロテオーム解析)

    • Author(s)
      金井好克
    • Organizer
      日本薬物動態学会第27回年会シンポジウム「トランスポーターの生理機能:統合的理解に向けて」
    • Place of Presentation
      東京
  • [Presentation] 悪性腫瘍のアミノ酸トランスポーター

    • Author(s)
      金井好克
    • Organizer
      第85回日本生化学会大会シンポジウム「分子標的トランスポーター」
    • Place of Presentation
      福岡市
  • [Presentation] アミノ酸トランスポーターLAT1阻害によるがん細胞増殖抑制.

    • Author(s)
      西中由美子、永森收志、 Printip Wongthai、遠藤 仁、金井好克
    • Organizer
      第85回日本生化学会大会.
    • Place of Presentation
      福岡市
  • [Presentation] Cellular responses to LAT1-mediated leucine uptake revealed by comprehensive phosphoproteomics.

    • Author(s)
      Pattama Wiriyasermkul, Shushi Nagamori, Satoshi Serada, Masaki Matsumoto, Keiichi I Nakayama, Tetsuji Naka, Yoshikatsu Kanai.
    • Organizer
      2012 American Society of Cell Biology (ASCB) Annual Meeting.
    • Place of Presentation
      San Francisco, USA
  • [Presentation] A C-terminus mutation of SLC7A9 amino acid transporter frequent in Japanese cystinuria patients retains substrate binding but diminishes the transport activity.

    • Author(s)
      Y. Kawamoto, S. Nagamori, P. Wiriyasermkul, Y. Kanai.
    • Organizer
      2012 American Society of Cell Biology (ASCB) Annual Meeting.
    • Place of Presentation
      San Francisco, USA.
  • [Presentation] A C-terminus mutation of b0,+AT/SLC7A9 amino acid transporter frequent in Japanese cystinuria patients binds substrates but diminishes the transport activity.

    • Author(s)
      Yasuharu Kawamoto, Shushi Nagamori, Saya Nakagomi, Pattama Wiriyasermkul, Yoshikatsu Kanai.
    • Organizer
      Nagoya Symposium; Frontiers in Structural Physiology.
    • Place of Presentation
      Nagoya, Japan.
  • [Presentation] Kinetic analysis of 3F-L-α-methyltyrosine (FAMT) transport by L-type amino acid transporter 1.

    • Author(s)
      Ling Wei, Hideyuki Tominaka, Pattama Wiriyasermkul, Yumiko Nishinaka, Ryuichi Ohgaki, Kenjiro Tadagaki, Shushi Nagamori, Yoshikatsu Kanai
    • Organizer
      第86回日本薬理学会年会
    • Place of Presentation
      福岡市
  • [Presentation] Boronophenylalanine; a rational carrier for 10B for BNCT, is transported by both LAT1 and LAT2.

    • Author(s)
      Printip Wongthai, Pattama Wiriyasermkul, Yumiko Nishinaka, Ryuichi Ohgaki, Kenjiro Tadagaki, Shushi Nagamori, Yoshikatsu Kanai.
    • Organizer
      第86回日本薬理学会年会
    • Place of Presentation
      福岡市
  • [Presentation] Cellular responses to LAT1-mediated leucine uptake are revealed by using an LAT1 inhibitor and comprehensive phosphoproteomics.

    • Author(s)
      Shushi Nagamori, Pattama Wiriyasermkul, Satoshi Serada, Masaki Matsumoto, Keiichi I Nakayama, Tetsuji Naka, Yoshikatsu Kanai
    • Organizer
      第86回日本薬理学会年会
    • Place of Presentation
      福岡市
  • [Book] トランスポートソーム:その生理的意義と疾患2013

    • Author(s)
      金井好克
    • Total Pages
      8
    • Publisher
      中外医学社

URL: 

Published: 2014-07-24  

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