2012 Fiscal Year Research-status Report
ＲＮＡ結合活性を有する癌遺伝子とｍｉＲＮＡの相互作用による肝細胞癌発生機序の解析
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24659362
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Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
東辻 宏明 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (60281094)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | RNA結合タンパク / 癌遺伝子 / miRNA / 肝細胞癌 |
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| Research Abstract |
Moderate-cold-shockやUV、hypoxiaで発現が誘導されるRBP、CIRPとRBM3はマウスのprimary cellの不死化とtransformationを誘導し癌遺伝子として機能する。ヒト癌でCIRPとRBM3は発現が亢進する。HepG2のtranscriptome全体からCIRPやRBM3に結合するtranscriptsを同定するために、biotin-streptavidin-based crosslinking and immunoprecipitation(CLIP) procedureを今回は使った。Tobacco Etch Virus endopeptidase cleavage siteの前にbiotin-ligase recognition site(BRS)を持ったCIRPあるいはRBM3蛋白質をBRS-CIRP (or RBM3)をビオチン化するバクテリアのBirA biotin ligaseと共にHepG2細胞株にstablyに共発現させた細胞クローンを得た。UVによってcrosslinkしたCIRPあるいはRBM3と相互作用するRNAsをstreptavidin上でsequenceするために、精製した。N端あるいはC端にBRSをつけたCIRPあるいはRBM3をstablyに発現させたクローンを使った２つの独立したCLIP-seq実験から高度に類似したシークエンスのデータセットを得た。転写物中にCIRPあるいはRBM3tと相互作用する部位を同定するために、CLIP-signalに対して転写の位置特異的な最低限の閾値をもうけて、局所的にenrichされたCLIP-sequences(clusters)を探すアルゴリズムを拡張した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
RNA-binding-protein(RBP)、CIRPとRBM3のtranscriptome内でのRNA結合部位の同定はsequencesのdatasetsとして得るところまでは終了した。3’-UTRは遺伝子発現のposttranscriptinal-regulationのハブの役目を負っていると考えられるので、HEH293のArgonauteタンパクのPAR-CLIPのdataと3’-UTR付近のCIRP、RBM3結合部位をcomputerで比較することを行う予定である。3’-UTRでのCIRPやRBM3のanchor部位の近くにある保存されたmiRNA-target-sites(miRNA-seeds)をPicTarあるいはTargetScanSによって、予測することを来年度に行う予定である。CIRPやRBM3の結合のpreferenceを調べるために、41-ntの中央付近の7-ntの出現頻度をPAR-CLIP法で解析する。この結果はin-vitro-protein-binding-microarray-assayで解析されたin-vitro-CIRP-binding-sites、in-vitro-RBM3-binding-motifsと一致するかどうかを検討する予定である。RNAのsecondary-structureはRBPsの結合の特異性に相関している。CIRPやRBM3の3’-UTR付近の結合配列がhairpin-loopを形成するかどうかをcomputerでfoldさせて、Base-pairing-probabilitiesを平均化して、CIRPやRBM3のanchor部位の近傍のpairing-probabilitiesが大きいのか、小さいのかを計算する。Hairpin-loopが形成されるかどうかも予測する予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
3’-UTRは遺伝子発現のposttranscriptinal-regulationのハブの役目を負っていると考えられるので、HEH293のArgonauteタンパクのPAR-CLIPのdataと3’-UTR付近のCIRP、RBM3結合部位をcomputerで比較する。3’-UTRでのCIRPやRBM3のanchor部位の近くにある保存されたmiRNA-target-sites(miRNA-seeds)をPicTarあるいはTargetScanSによって、予測する。CIRPやRBM3がHuRと同じようにmRNA-stabilization-effectを3’-UTRのARE-sequenceに結合するような機序を介していくつかのmRNAを安定化しているかどうかを解析する。CIRPやRBM3のタンパク合成に対する影響を調べる。pulsedSILAC(pSILAC)-proteomics-measurementsという方法で測定する。CIRPやRBM3は3’-UTRだけではなくintronsにも好んで結合している可能性がある。我々の得たｍRNA-sequencing-dataをCIRPやRBM3に依存したalternative-splicingをもつ遺伝子についてスクリーニングする。RBPs、CIRPやRBM3がそのmiRNA-processingに関与しているmiRNAを同定する。miRNA-CIRP-interplayあるいはmiRNA-RBM3-interplayによって影響を受けるmiRNAをPAR-CLIPのシークエンスデータとmiRNA-seedsのシークエンスデータを比較することで見つけ出す。RBPｓがknockdownした場合、HepG2のphenotypeはどのように変化するか検討する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
該当なし。
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Research Products
(5 results)
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[Journal Article] Cold-inducible RNA-binding protein (Cirp) interacts with Dyrk1b/Mirk and promotes proliferation of immature male germ cells in mice.2012
Author(s)
Masuda T, Itoh K, Higashitsuji H, Higashitsuji H, Nakazawa N, Sakurai T, Liu Y, Tokuchi H, Fujita T, Zhao Y, Nishiyama H, Tanaka T, Fukumoto M, Ikawa M, Okabe M, Fujita J.
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Journal Title
Proc Natl Acad Sci U S A.
Volume: 109
Pages: 10885-10890
DOI
Peer Reviewed
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