2013 Fiscal Year Research-status Report
ＲＮＡ結合活性を有する癌遺伝子とｍｉＲＮＡの相互作用による肝細胞癌発生機序の解析
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24659362
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
東辻 宏明 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (60281094)
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| Keywords | RNA結合蛋白 / がん遺伝子 / miRNA / 相互作用 / 肝細胞癌 |
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| Research Abstract |
ヒト癌でRNA結合蛋白CIRPとRBM3は発現が亢進。moderate cold shock（〜32℃）や紫外線、低酸素で発現が誘導されるCIRPとRBM3はmurine primary cellの不死化とtransformationを誘導し癌遺伝子として機能。CIRPはマウスの時計遺伝子をposttranscriptionallyに調節する。CIRPは細胞外に分泌されて、敗血症や大量出血後の炎症反応を促進。HepG2のtranscriptome全体からCIRPやRBM3に結合するtranscriptsを同定。biotin streptavidin based crosslinking and immunoprecipitation(CLIP)。TEV endopeptidase cleavage siteの前にbiotin ligase recognition site(BRS)を持ったCIRPあるいはRBM3を発現するvectorとBRSをビオチン化するバクテリアBirA biotin ligaseを発現するvectorを共にHepG2細胞株にstablyに発現。CIRPやRBM3と結合するRNAsはbiotinとstreptoavidinの強固な結合により、UV crosslink後、streptavidinにて精製。精製RNAsは別のvectorにligateされ、次世代シークエンサーで塩基配列を決定。N端あるいはC端にBRSをつけたCIRPあるいはRBM3をs発現させたクローンを使った２つの独立したCLIP seq実験からシークエンスのデータセットを得た。転写物中にCIRPあるいはRBM3と相互作用する部位を同定。CLIP signalに対して転写の位置特異的な最低限の閾値をもうけて局所的にenrichされたCLIP sequencesを探すアルゴリズム。CIRPに結合するRNAsの中にがん抑制遺伝子であるBRCA1、BRCA2。BRCA1、BRCA2 は細胞のDNA damage後のhomologous recombinationに関与する。細胞のDNA damage (cis-platinによる)後のcolony formation assayではDNA damage 時に細胞を32℃に置くことにより、37℃の場合に比較して、homologous recombinationによるDNA repairが促進。このメカニズムにCIRPのBRCA RNAに対するposttranscriptionallyな調節機構が関与。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
RBPであるCIRPとRBM3のtranscriptome内でのRNA結合部位はsequencesのdatasetsとして得た。3’-UTRは遺伝子発現のposttranscriptinal regulationのハブであるので、HepG2のArgonauteのPAR-CLIPのsequence datasetsと3’-UTR付近のCIRP、RBM3結合部位をcomputerで比較。3’-UTRでのCIRPやRBM3のanchor部位の近くにあるmiRNA target sitesをPicTar、TargetScanSによって予測。CIRPやRBM3の結合のpreferenceを調べるために41-ntの中央付近の7-ntの出現頻度をPAR-CLIP法で解析。in vitro protein binding microarray assayで解析された binding sitesと一致するかどうかを検討。ある程度の一致。RNAのsecondary-structureはRBPsの結合の特異性に相関。CIRPやRBM3の3’-UTR付近の結合配列がhairpin loopを形成するかどうかをcomputerでfoldさせて、Base pairing probabilitiesを平均化して、CIRPやRBM3のanchor部位の近傍のpairing probabilitiesを計算。Hairpin-loopの予測。CIRP RBPはがん抑制遺伝子BRCA1 、BRCA2に3’-UTRを介して結合。BRCA1、BRCA2に対するmiRNAsに対してもCIRPは結合。BRCA1、BRCA2に対するmiRNAに結合により安定化。
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| Strategy for Future Research Activity |
3’-UTRは遺伝子発現のposttranscriptinal regulationのハブなので、ArgonauteのPAR-CLIPのdataと3’-UTR付近のCIRP、RBM3結合部位をcomputerで比較、3’-UTRでのCIRPやRBM3のanchor部位の近くにあるmiRNA target sitesをPicTa、TargetScanSによって予測。CIRPはBRCA1、BRCA2の3’-UTRに結合、BRCA1、BRCA2のmiRNAsにも結合。他のDNA damage responseに関与した分子の3’-UTR、miRNAがCIRPあるいはRBM3への結合の有無。
CIRPやRBM3がHuRのようにmRNA stabilization effectを3’-UTRのARE sequenceに結合する機序を介してmRNAを安定化。BRCA1、BRCA2について。CIRPやRBM3のタンパク合成に対する影響を調べる。pulsed SILAC proteomics measurements。CIRPやRBM3はintronsにも結合。RNA sequencing dataからCIRPやRBM3に依存したalternative splicingをもつ遺伝子の探索。CIRPやRBM3がそのmiRNA processingに関与しているmiRNAを同定。miRNA CIRP interplayあるいはmiRNA RBM3 interplayによって影響を受けるmiRNAをPAR-CLIPのデータとmiRNA seedsのデータを比較。CIRPがBRCA1、BRCA2 miRNAsに結合することによる影響。RBPｓがknockdownした場合、HepG2のphenotypeの変化。CIRPがoverexpress、あるいはknockdownされた場合、他のhomologous recombinationに関与する遺伝子の発現への影響。non-homologous recombinationに関与する遺伝子の発現量の変化。Direct repeat recombinationをassayするU-2OS DR-GFPを作製する。Homologous recombinationへの32℃、CIRP、RBM3、BRCA1、BRCA2の関与。
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[Journal Article] Hypothermia protects against fulminant hepatitis in mice by reducing reactive oxygen species production.2013
Author(s)
Sakurai T, Kudo M, Watanabe T, Itoh K, Higashitsuji H, Arizumi T, Inoue T, Hagiwara S, Ueshima K, Nishida N, Fukumoto M, Fujita J.
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Journal Title
Dig Dis.
Volume: 31(5-6)
Pages: 440-446
DOI
Peer Reviewed
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