2014 Fiscal Year Annual Research Report
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24687026
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| Research Institution | National Institute of Genetics |
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Principal Investigator |
北川 大樹 国立遺伝学研究所, 新分野創造センター, 特任准教授 (80605725)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 中心小体 / 中心体 / 細胞分裂 / 微小管形成中心 / 染色体不安定化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
前年度までに明らかにした、RBM14がde novo中心小体形成を抑制する分子機構に関して詳細を明確にした。すなわち、RBM14がSTIL-CPAP複合体形成を、STILに対する結合を介して競合的に抑制することを精製タンパク質を用いたin vitro再構成実験により直接的に示した。また、通常の中心小体複製に関与するSTIL-CPAP複合体形成には、RBM14は関与せずに、細胞質において余剰に形成されたSTIL-CPAP複合体にのみ作用することでde novo中心小体形成のみを抑制する事を示した。この結果は、de novo中心小体形成とcanonicalな中心小体形成の分子機構の異なる点の一端を提示する重要な知見である。また、de novo形成された中心小体様構造の微小管重合能を細胞内で検討する系を確立し、それらの構造の半数程度が微弱ながらも微小管重合能を有することを見出した。この系においてde novo形成された中心小体様構造のうち、紡錘体極を単独で形成する割合は比較的低いこともわかった。しかし、このような多極化した紡錘体を有する細胞が分裂後に生じる娘細胞の生存率は低い。現在、我々は、紡錘体極を単独では形成できないが、微弱な微小管重合能を有するde novo中心小体様構造はlong-termでみた場合に、細胞分裂を成立させつつも染色体分配のマイナーエラーを蓄積させ、細胞がん化を誘導するのではないかと推測している。この可能性に関して、有用なアッセイ系を確立し検討することも試みている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
中心小体複製ライセンス化を制御する因子として同定したRBM14の機能解析、特にde novo中心小体形成を抑制する分子機構に関する充分なデータ量を示すことを達成し、一連の研究結果をEMBO誌に掲載することができた。また、段階的な中心小体形成をモニターする手法として、光学顕微鏡技術と電顕観察を併用したCLEMのセットアップを行う事ができ、今後の構造生物学的解析の基盤を確立することができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
1. 中心小体過剰複製を抑制するRBM14の機能解析
-RBM14発現抑制により過剰複製された中心小体の構造学的解析: RBM14発現抑制により過剰に複製された中心小体が内在のものと構造的にどの程度類似しているかに関して、中心小体の段階的な構築過程が判別可能な各種分子マーカーを用いた免疫染色により明らかにする。電子顕微鏡による構造学的解析も行う。さらには、tubulin抗体、核染色剤を用いて、分裂期紡錘体形成及び染色体分配への影響に関しても観察する。
-RBM14-STIL複合体形成の細胞周期上の時期、細胞内局在の特定: RBM14は間期には核内パラスペックル構造に局在し、分裂期には中心小体近傍に局在することをこれまでに見出している。よって、RBM14-STIL複合体は分裂期に中心小体近傍にて形成されることが推測される。細胞周期を同調したヒト培養細胞にて免疫染色を行い、超解像度顕微鏡システムを利用して中心小体のどこでどの時期に共局在するか、詳細を解析する。
2. RBM14に結合しうるRNAの同定
RBM14はRNA結合ドメインを有するタンパク質であり、RBM14-STIL複合体に相互作用するRNAを生化学、次世代シークエンシングを用いて同定し、中心小体形成への関与を検討する。
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| Causes of Carryover |
平成２６年度に遂行された実験が計画されていたよりもスムーズに進み、換算されていた消耗品費の未使用分が次年度使用額として派生した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度の研究費と合わせ、遺伝子関連実験試薬、タンパク質関連実験試薬、培養細胞実験試薬などを購入するための物品費として使用する予定である。
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