2013 Fiscal Year Annual Research Report
水酸化アミノ酸をトレーサーとするペプチド生合成遺伝子資源の新規開拓
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24688010
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
日比 慎 京都大学, (連合)農学研究科(研究院), 助教 (30432347)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 機能性ペプチド / 水酸化アミノ酸 |
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| Research Abstract |
本研究ではアミノ酸水酸化酵素の一種であるα-ケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼ(DO)を新規に取得し、その触媒機能性および遺伝子構造情報の詳細な解析結果を利用することで、有用な機能性を保持する新規ペプチド分子種の探索と効率的な生合成手法の開発を実施する。
本年度までに実施したスクリーニングにより、アミノ酸の水酸化反応を触媒する新規DOを数種類得ている。例えばBurkholderia ambifaria AMMD由来のDOであるSadAはN置換L-アミノ酸類のβ位水酸化酵素であり、またFusarium属糸状菌やAspergillus属糸状菌由来のDO類はプロリンなどの環状アミノ酸類に対する４位水酸化活性を保持していることを見出している。以上で取得したDO類の内、SadAはB. ambifaria AMMDのゲノム中において１６種類の遺伝子から構成されるクラスター構造の一部を形成していた。本クラスターの中には非リボソームペプチド合成酵素（NRPS）様遺伝子も含まれていたことから、本クラスターがある種のペプチド生合成遺伝子群であることが示唆されたため、SadA周辺遺伝子の機能解析を実施した。その結果SadA（Bamb_6045）の上流にコードされているLasA（Bamb_6046）がアミノ酸のスクシニル化・脱スクシニル化活性を保持していることを明らかにした。さらにBamb_6051はNRPSのamino acid adenylation domainと高い相同性を示しており、実際にL-Ala、L-Cys、L-Val、L-Ile、L-Leuに対してアデニル化活性を保持していることを示した。以上の様にアミノ酸のN-スクシニル化、β位水酸化、そしてアデニル化がこの生合成経路において一連の反応として起きていることがわかり、本ペプチドの生合成経路の解明に近づいた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度までに、当研究における目標の一つであるアミノ酸の水酸化反応を触媒する新規DO類を複数取得できており、これらDO類を含むペプチド生合成クラスターに関して順次解析を進めている。例えばB. ambifaria AMMDのペプチド生合成クラスターに関して詳細な検討を実施した結果、N置換L-アミノ酸β位水酸化酵素であるSadA、アミノ酸スクシニル化酵素であるLasA、アミノ酸アデニル化酵素であるBamb_6051の協調的な作用により生合成経路が機能していることを明らかにしている。この結果を基にして本ペプチド生合成クラスターにより生産されるペプチドの構造に関して、ある程度の推定ができるようになっている。以上のように当研究の最終目標である新規ペプチド生合成経路の全容解明に向けて概ね順調に進展しているといえる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後はSadAや他の新規DO類を含むペプチド生合成クラスターの全容解明のため、ペプチド構造決定と各生合成酵素の触媒機能解析を進める。まずペプチド構造決定のためには、DO反応を利用して生産した同位体標識水酸化アミノ酸を用いる。例えば同位体基質である13C-N置換LeuをSadAの作用により水酸化した後、B. ambifaria AMMDの培養液に投入し、その後当菌が生産する同位体ペプチドを単離してNMRやLC-MSにより分子構造解析を進める。一方で各生合成酵素の遺伝子クローニングも進めていき、主にアミノ酸やペプチドに対する触媒特性とその基質特異性の解析を実施する。ここでは現在までの解析で明らかになっている情報を駆使することで、より効率的に解析を進めることができる。例えばB. ambifaria AMMDのペプチド生合成酵素類に関しては、SadA、LasA、Bamb_6051と組み合わせて活性評価することで、連続的な複合酵素反応機構を解明することができる。
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[Journal Article] Breeding of a cyclic imide-assimilating bacterium, Pseudomonas putida s52, for high efficiency production of pyruvate2013
Author(s)
M. Hibi, N. Horinouchi, W. Tu, C.L. Soong, M. Ito, T. Segawa, X. Mu, T. Hagishita, K. Yokozeki, S. Shimizu, J. Ogawa
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Journal Title
Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry
Volume: 77
Pages: 1650-1654
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Crystal Structure of a Novel N-Substituted L-Amino Acid Dioxygenase from Burkholderia ambifaria AMMD2013
Author(s)
H.M. Qin, T. Miyakawa, M.Z. Jia, A. Nakamura, J. Ohtsuka, Y.L. Xue, T. Kawashima, T. Kasahara, M. Hibi, J. Ogawa, M. Tanokura
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Journal Title
PLOS ONE
Volume: 8
Pages: e63996
DOI
Peer Reviewed
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