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2013 Fiscal Year Annual Research Report

生きた細胞内でのオートファジー発光定量法の開発

Research Project

Project/Area Number 24710259
Research InstitutionThe University of Tokyo

Principal Investigator

服部 満  東京大学, 理学(系)研究科(研究院), 研究員 (20589858)

Keywordsオートファジー / ルシフェラーゼ / 発光
Research Abstract

本申請研究では, 細胞の維持機構の一端である「オートファジー」現象を対象とし, 生きた細胞内にて発光検出する方法を開発する.発光検出する原理として, 発光タンパク質ルシフェラーゼを用いたタンパク質再構成法を導入する. タンパク質再構成法は, 2断片に分割したルシフェラーゼが接近する際に, 再び発光活性が回復する原理であり, ルシフェラーゼ2断片をそれぞれ各種オートファジーに関するタンパク質へ連結させることで, オートファジー下におけるタンパク質間相互作用の検出を可能とする.
最終年度では, これまで開発を行ってきたルシフェラーゼプローブの改良を行った. 前年度までのプローブの発光強度は最低限の感度を満たしているものの, 細胞イメージングなどの用途にはその発光強度は不十分であった. そこで,発光強度が強く且つ安定しているNanoLucルシフェラーゼを導入した.まず, NanoLucの再構成法上での最適な切断位置を決定した. 切断位置の予測に関しては, 先行論文を参照し, アミノ酸配列の特徴, 極性から候補位置を選出して随時確認した. 最終的に決定した切断位置でNanoLucを分断し, オートファジー関連遺伝子と融合させて細胞用発現ベクターを作製した. 精製した発現ベクターをヒト培養細胞に導入したのち, その発光値を確認した. オートファジーは培地の栄養条件が劣悪になった場合誘導されることから, 血清およびアミノ酸を除いた培地に置き換えて培養を行った. その結果,前年度のプローブと比較して, 100倍以上の発光値が観測された.
さらに, オートファジー関連タンパク質に結合するドメインを利用する事で, 内在のタンパク質量を反映した発光検出法の可能性も見出した.

  • Research Products

    (9 results)

All 2014 2013 Other

All Journal Article (3 results) (of which Peer Reviewed: 3 results) Presentation (5 results) Book (1 results)

  • [Journal Article] Sustained Accurate Recording of Intracellular Acidification in Living Tissues with a Photo-controllable Bioluminescent Protein2013

    • Author(s)
      Hattori, M., Haga, S., Takakura, H., Ozaki, M. and Ozawa, T.
    • Journal Title

      Proc. Nat. Acad. Sci. USA

      Volume: 110 Pages: 9332-9337

    • DOI

      10.1073/pnas.1304056110

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] ROS stress resets circadian clocks to coordinate pro-survival signals.2013

    • Author(s)
      Tamaru, T., Hattori, M., Ninomiya, Y., Kawamura, G., Vares, G., Honda, K., Mishra, D. P., Wang, B., Benjamin, I., Sassone-Corsi, P., Ozawa, T. and Takamatsu, K.
    • Journal Title

      PLoS ONE

      Volume: 8 Pages: e82006

    • DOI

      10.1371/journal.pone.0082006

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Bioluminescent Probes to Analyze Ligand-induced Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate Production with Split Luciferase Complementation2013

    • Author(s)
      Yang, L. Z., Nasu, Y., Hattori, M., Yoshimura, H., Kanno, A. and Ozawa, T.
    • Journal Title

      Anal. Chem.

      Volume: 85 Pages: 11352-11359

    • DOI

      10.1021/ac402278f

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] 光応答性ルシフェラーゼによる生きた組織下でのpH時間変化モニタリング法の開発

    • Author(s)
      服部満, 芳賀早苗, 高倉栄男, 尾崎倫孝, 小澤岳昌
    • Organizer
      日本分析化学会第62年会
    • Place of Presentation
      近畿大学東大阪キャンパス(大阪府)
  • [Presentation] 神経軸索誘導タンパク質の光による活性制御法の開発

    • Author(s)
      遠藤瑞己, 服部満, 小澤岳昌
    • Organizer
      第3回CSJ化学フェスタ2013
    • Place of Presentation
      タワーホール船堀(東京都)
  • [Presentation] 時計リセットシグナルによるROSストレス応答系の制御

    • Author(s)
      田丸輝也, 服部満, 二宮康晴, 河村玄気, 小澤岳昌, 高松研
    • Organizer
      第20回日本時間生物学会学術大会
    • Place of Presentation
      近畿大学東大阪キャンパス (大阪府)
  • [Presentation] 生きた細胞内における内在性テロメアRNAの一分子動態解析

    • Author(s)
      山田俊理・吉村英哲・服部満・小澤岳昌
    • Organizer
      日本生物物理学会第51回年会
    • Place of Presentation
      国立京都国際会館(京都府)
  • [Presentation] Bioluminescence analysis of relationship between the class of GPCR and temporal pattern of GPCR–b-arrestin interaction

    • Author(s)
      服部満, 田中みほ, 高倉栄男, 小澤岳昌
    • Organizer
      日本化学会第94春季年会
    • Place of Presentation
      名古屋大学 東山キャンパス (愛知県)
  • [Book] Clinical Neuroscience 32(2), p128-129, GPCRに作用する化合物のスクリーニング2014

    • Author(s)
      服部満, 田中みほ, 小澤岳昌
    • Total Pages
      2
    • Publisher
      中外医学社

URL: 

Published: 2015-05-28  

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