2012 Fiscal Year Research-status Report
細胞外分子シャペロンの新たな機能と病原細菌のバイオフィルム形成機構
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24780079
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Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
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| Research Institution | Jikei University School of Medicine |
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Principal Investigator |
杉本 真也 東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (60464393)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 分子シャペロン / ブドウ球菌 / 細胞外マトリクス / バイオフィルム / ClpB / DnaK / 病原細菌 |
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| Research Abstract |
本研究では、細胞外に排出された細胞質分子シャペロンDnaKおよびClpBのバイオフィルム形成における役割や作用機序を解明することを目的とし、以下の点について検討した。
①変異体ClpBを用いた機能ドメインの解析：8種類の変異体（ドメイン欠損変異体6種＆ATPase活性を失った変異体2種）を用いて、黄色ブドウ球菌バイオフィルム形成の促進効果を解析した結果、少なくともN末端ドメインからMiddleドメインまでの領域が重要であることと、従来より知られていた分子シャペロンとしての機能（凝集タンパク質の脱凝集）は必須ではないことを明らかにした。
②バイオフィルム形成におけるDnaKおよびClpBの役割：バイオフィルム形成のプロセスは、初期付着と成熟の２つのステージに大別されるが、DnaKとClpBはバイオフィルム形成のすべてのステージにおいて黄色ブドウ球菌の細胞表層に存在していることを蛍光抗体染色法により明らかにした。また、DnaKとClpBはすべてのステージにおいてバイオフィルム形成を有意に促進しうることを明らかにした。これらの結果より、DnaKとClpBは初期付着から成熟までの過程において重要な役割を果たしている可能性が示唆された。
③様々な病原細菌に対するDnaKおよびClpBのバイオフィルム形成促進効果：DnaKとClpBはグラム陽性細菌の黄色ブドウ球菌だけでなく、グラム陰性細菌である大腸菌と緑膿菌のバイオフィルム形成も促進することがわかった。
これらの成果は、分子シャペロンの機能をめぐる概念を大きく書き換える新しい知見である。また、細胞外分子シャペロンのバイオフィルム形成促進機能が黄色ブドウ球菌のみならず、他の病原細菌においても認められたことより、単なる一細菌における興味深い現象の発見だけにとどまらず、医学的・細菌学的重要性を示すことができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当該年度に予定していた研究項目（変異体ClpBを用いた機能ドメインの解析、バイオフィルム形成におけるDnaKおよびClpBの役割の解明）のみならず、次年度以降に予定していた研究項目の一部（バイオフィルム形成におけるDnaKおよびClpBの局在性の変化、様々な病原細菌に対するDnaKおよびClpBのバイオフィルム形成促進効果）についても研究を遂行し、興味深い知見を得た。一部の研究成果については、すでに学術論文や国内外での学会で発表済みである。それ以外の成果についても、学術論文の投稿へ向けて準備を進めている。一方、当該年度に予定していた一部の項目（変異体DnaKを用いた機能ドメインの解析）については解析中であり、今後、フレキシブルにスケジュールを修正しながら研究を推進していく必要がある。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、当該年度に達成することができなかった研究項目を含め以下の点について検討する。
①変異体DnaKを用いた機能ドメインの解析：すでに野生型DnaK発現プラスミドの作製は完了しており、これをもとに5種類のドメイン欠損変異体を発現するプラスミドを作製する。その後、変異体DnaKタンパク質を本研究室所有の自動タンパク質精製装置を用いて精製し、黄色ブドウ球菌のバイオフィルム形成に与える効果を評価する。
②細胞外分子シャペロンDnaKおよびClpBが認識する細胞表層分子の探索：His-tagを融合したDnaKおよびClpBタンパク質の精製標品と黄色ブドウ球菌の細胞表層画分を混合し、相互作用する分子をHis-tag pull down法により回収する。得られた相互作用分子は本学共同研究施設に保有のLC-MS/MSを用いて同定する。
③バイオフィルム形成におけるDnaKおよびClpBの局在性の変化：これまでに蛍光抗体染色によって観察したDnaKとClpBの局在変化を大気圧走査電子顕微鏡を用いた免疫電子顕微鏡観察によって詳細に解析する。本装置を用いた解析は、産業技術総合研究所の佐藤主税博士の協力のもと推進していく。
得られた成果は、国際会議（FEMS Microbiology Congress 2013や10th International Conference on AAA Proteins）や学術論文での発表を予定している。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
計画している研究に必要な分子生物学実験試薬や生化学試薬などの消耗品を購入する。また、研究成果の発表を予定している国際会議への参加費・旅費・宿泊費や論文投稿にかかる経費（英文校閲費用、投稿料、掲載料）としての使用を計画している。
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[Presentation] Bacterial ATP secretion2013
Author(s)
Hironaka I, Iwase T, Sugimoto S, Okuda K, Tajima A, Yanaga K, Mizunoe Y
Organizer
Annual Conference of the Association for General and Applied Microbiology.
Place of Presentation
Bremen, Germany
Year and Date
20130310-20130313
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