放射線治療抵抗性がんに対するＲＡＤ５１を標的とした新規治療法の開発

2012 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 24780313
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Research Institution: Nippon Veterinary and Life Science University
• Principal Investigator: 落合 和彦 日本獣医生命科学大学, 獣医学部, 講師 (30550488)
• Project Period (FY): 2012-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: 乳癌 / BRCA2 / RAD51 / 分子創薬

Research Abstract

DNA相同組換え修復酵素であるRAD51は、電離放射線等によるDNAの2重鎖切断発生時における相同組換え修復に必須である。しかし、RAD51高発現がん細胞においては相同組換え修復効率の亢進により放射線治療抵抗性が生じる場合がある。本申請課題においては、腫瘍性疾病が多いイヌより分離した種々のがん組織由来株化細胞を用い、RAD51の発現量と放射線治療抵抗性の相関を探るとともに、機能分子BRC repeatを用いた、RAD51を基軸とするDNA相同組換え修復効率の制御を標的とした新規治療戦略の開発に向けた臨床応用研究を行うことを目的とした。
当該年度においては、イヌ乳腺腫瘍細胞株のうち、RAD51高発現細胞株および低発現細胞株の選定を細胞内RAD51タンパク質発現量をウエスタンブロット法により半定量した。またそれぞれの細胞株について放射線感受性とRAD51発現量の相関についても検討した。さらに、RAD51高発現放射線治療抵抗細胞株において、相同組換え効率の亢進を制御できる可能性があるイヌBRCA2のBRC repeat（BRC）の部分配列についてさらに検討した。具体的にはイヌのBRC3に存在する多型配列のうちK1435RがRAD51との相互作用を増強する点に注目し、詳細な解析を行い学術雑誌に発表した（Yoshikawa Y., Ochiai K., and et al., 2012. PLoS ONE）。また、RAD51との相互作用能力が最も高いイヌBRC4に既報の相互作用増強配列を組み込んだ改変分子を作製し、その機能解析を行った。本研究成果の一部は第154回日本獣医学会学術集会において発表した。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

当該年度においては、イヌの乳腺腫瘍細胞株におけるRAD51の発現状況および放射線感受性の相関を解析に着手した。RAD51の発現は細胞周期等により増減するため、各種細胞の細胞周期をG0～G1期に同期化する必要があった。しかし、技術的な改善により各細胞株が持つRAD51タンパク質発現量を、細胞周期を同期化した状態で正確に定量することが可能となったことは非常に大きな成果である。
また、RAD51高発現放射線治療抵抗細胞株に対するDNA相同組換え修復効率制御機能分子である改変型BRC分子の開発に関して、イヌBRC3領域の多型解析からK1435E改変によるRAD51親和性増加因子を発見し、詳細な解析を行い査読付き国際学術雑誌PLoS ONEに発表した。これにより、RAD51による相同組換え修復を制御できる可能性がある機能分子の開発が加速化し、分子創薬の基盤が構築された。
以上の成果より、本研究課題の進捗は非常に順調であり、当初の計画以上に進行していると自己評価する。

Strategy for Future Research Activity

申請者がこれまでに同定したV1532I 置換に加え、各種文献で言及されているRAD51 結合力増強に繋がるアミノ酸置換[Rajendra and Venkitaraman, 2010. Nuc. Acid Res., Nomme et al. 2010. J. Med.Chem.]を施した改変型BRC 分子を構築し、RAD51との結合力を、申請者を主著とする論文で使用されている実験方法であるMammalian Two-Hybrid Assayにより定量する。さらに平成24年度実施研究により見出されたK1435Eに相当するアミノ酸置換も行い、より強くRAD51と相互作用するBRC分子の開発および評価をおこなう。評価方法については前述のMammalian Two-Hybrid Assayだけでなく、BRCペプチドを用いたin vitro実験などにも着手することを目標とする。さらに、生体への投与実験を視野に入れたDrug Delivery Systemの開発に向けた基礎研究への移行を模索する予定である。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

平成24年度については研究の基幹となる培養細胞を用いた実験に必須な炭酸ガス細胞培養装置を高額機器として購入し、研究の加速化に成功した。次年度については、細胞培養実験を主に実施するため「物品費」の割合を大きくする予定である。また、各種BRC分子構築の際のDNA配列確認のためのシーケンス作業を外注するため「その他」に該当する予算執行もある程度見込まれる。さらに、研究成果の公表および研究遂行のための技術習得・情報交換のための「旅費」についても若干執行する予定である。

Research Products

• [Journal Article] Preclinical Safety and Efficacy of in Situ REIC/Dkk-3 Gene Therapy for Prostate Cancer. (2012)
  • Author(s): Kawauchi, K., Watanabe, M., Kaku, H., Huang, P., Sasaki, K., Sakaguchi, M., Ochiai, K., Huh, NH., Nasu, Y., and Kumon, H.
  • Journal Title: Acta Med. Okayama Volume: 66 Pages: 7-16
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Establishment of a PCR analysis method for canine BRCA2. (2012)
  • Author(s): Yoshikawa, Y., Morimatsu, M., Ochiai, K., Okuda, K., Taoda, T., Chikazawa, S., Shimamura, A., Omi, T., Bonkobara, M., Orino, K., and Watanabe, K.
  • Journal Title: BMC Res. Notes Volume: 5 Pages: 173
  • DOI: doi:10.1186/1756-0500-5-173
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A novel gene expression system for detecting viable bladder cancer cells. (2012)
  • Author(s): Ueki, H., Watanabe, M., Kaku, H., Huang, P., Li, SA., Ochiai, K., Hirata, T., Noguchi, H., Yamada, H., Takei, K., Nasu, Y., Kashiwakura, Y., and Kumon, H.
  • Journal Title: Int. J. Oncol. Volume: 41 Pages: 135-140
  • DOI: doi: 10.3892/ijo.2012.1417
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] PKR plays a positive role in osteoblast differentiation by regulating GSK-3β activity through a β-catenin-independent pathway. (2012)
  • Author(s): Yoshida, K., Okamura, H., Ochiai, K., Hoshino Y., Haneji, T., Yoshioka, M., Hinode, D., and Yoshida, H.
  • Journal Title: Mol. Cell. Endocrinol. Volume: 361 Pages: 99-105
  • DOI: doi.org/10.1016/j.mce.2012.03.019
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Effects of the Missense Mutations in Canine BRCA2 on BRC Repeat 3 Functions and Comparative Analyses between Canine and Human BRC Repeat 3. (2012)
  • Author(s): Yoshikawa, Y., Ochiai, K., Morimatsu, M., Suzuki, Y., Wada, S., Taoda, T., Iwai, S., Chikazawa, S., Orino, K., and Watanabe, K.
  • Journal Title: PLOS ONE Volume: 7 Pages: e45833
  • DOI: doi:10.1371/journal.pone.0045833
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Thiol-organosilica Particles Internally Functionalized with Propidium Iodide as a Multicolor Fluorescence and X-Ray Computed Tomography Probe and Application for Non-Invasive Functional Gastrointestinal Tract Imaging. (2012)
  • Author(s): Nakamura, M., Awaad, A., Hayashi, K., Ochiai, K., and Ishimura, K.
  • Journal Title: Chem. Mater. Volume: 24 Pages: 3772-3779
  • DOI: doi.org/10.1021/cm3023677
  • Peer Reviewed
• [Presentation] イヌ乳腺腫瘍関連遺伝子BRCA2のBRC repeat 3に存在するSNPsの頻度および機能に及ぼす影響の検討 (2013)
  • Author(s): 落合和彦、塩入弓絵、染田沙織、大澤有加、宇田川智野、森松正美、吉川泰永、盆子原誠、土田修一、近江俊徳
  • Organizer: 第155回日本獣医学会
  • Place of Presentation: 東京大学
  • Year and Date: 20130328-20130330
• [Presentation] 動物種間DNA構造解析によって得られたBRCA2の多型配列がRAD51との相互作用に与える影響の検討 (2012)
  • Author(s): 落合和彦、多田尚美、宇田川智野、近江俊徳
  • Organizer: 第21回日本DNA多型学会
  • Place of Presentation: 京都教育文化センター
  • Year and Date: 20121108-20121109
• [Presentation] 放射線治療抵抗性がんに対するRAD51の制御を基軸とした改変型BRCによる新規治療戦略の開発に向けた基礎研究 (2012)
  • Author(s): 落合和彦、森松正美、吉川泰永、宇田川智野、多田尚美、近江俊徳
  • Organizer: 第154回日本獣医学会
  • Place of Presentation: 岩手大学
  • Year and Date: 20120914-20120916
• [Presentation] イヌ乳腺腫瘍で発見した癌関連遺伝子産物BRCA2における変異BRC repeat 3の機能解析 (2012)
  • Author(s): 吉川泰永、森松正美、落合和彦、相田成一、垰田高広、近澤征史朗、岩井聡美、折野宏一、渡辺清隆
  • Organizer: 第154回日本獣医学会
  • Place of Presentation: 岩手大学
  • Year and Date: 20120914-20120916