2012 Fiscal Year Research-status Report
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24790875
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Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
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| Research Institution | Niigata University |
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Principal Investigator |
横関 明男 新潟大学, 医歯(薬)学総合研究科, 特任准教授 (90515719)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | TDP-43 / ALS / GEM / SMN |
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| Research Abstract |
筋萎縮性側索硬化症(ALS)の発症に強く関与する核内蛋白であるTDP-43の発現低下により，核内小体の一つであるGEM小体の構成蛋白であるSMN(survival motor neuron)の動態の変化を確認するため，下記の実験を行った．
1.TDP-43の発現抑制によるSMN小体数の変化 核内小体の研究で広く使用されているHeLa細胞を用いて，TDP-43をsiRNAで発現を抑制し，抗体SMN抗体で免疫染色し，蛍光顕微鏡で観察してSMN小体の数を計測した．コントール，およびTDP-43発現抑制細胞それぞれ200細胞ずつ観察し，1細胞あたりのSMN小体の数を計測した．コントロール，2.97±0.127(平均±標準誤差)；TDP-43抑制細胞，1.54±0.93であり，TDP-43の発現が低下すると，SMN 小体の数が減少することを明らかとした(P<0.001，Mann-Whitney’s U test).
2.TDP-43の発現抑制によるSMN蛋白量の変化 上記細胞を用いて，ウエスタンブロット法で，SMNの蛋白量の変化を確認した．TDP-43の発現抑制を抑制すると，SMN蛋白量が低下することを明らかとした．
3.疾患関連変異TDP-43の細胞内動態の解析 14種類の疾患関連変異および野生型TDP-43をC6細胞にトランスフェクションし，可溶性画分であるTris画分と不溶性画分であるSDS(sodium dodecyl sulfate)画分に分画化し，ウエスタンブロットを行った．Tris画分と比較してSDS画分に断片化されたTDP-43が多く検出されたが，野生型と変異型との間では違いは見いだせなかった．
上記の結果から，TDP-43の発現量が低下すると，SMNの数および蛋白が低下することを明らかとした．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
TDP-43の発現低下が，RNA代謝に関与する核内小体に影響を与えることを，培養細胞を用いて証明することができたため，平成24年度の実施すべき目標は概ね実施することができたと考える．
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| Strategy for Future Research Activity |
平成24年度の研究で，培養細胞を用いて証明したSMNの低下が，ALS症例で生じているか否かを確認するため，剖検検体を用いて確認する．具体的には，弧発性ALSおよび神経変性疾患を合併していないコントロールの脊髄前角細胞を用いて，抗体SMN抗体による免疫染色，ウエスタンブロットを行い，SMNの数，量を確認する．またSMN小体の体積も，画像解析ソフトを使用して解析する予定である．
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
上記研究を実施するにあたり，免疫染色の抗体や試薬，細胞への遺伝子導入やsiRNAなどの消耗品，シークエンス関連試薬，細胞培養の試薬などの消耗品の購入を行う予定である．
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[Journal Article] Japanese amyotrophic lateral sclerosis patients with GGGGCC hexanucleotide repeat expansion in C9ORF722013
Author(s)
Konno T, Shiga A, Tsujino A, Sugai A, Kato T, Kanai K, Yokoseki A, Eguchi H, Kuwabara S, Nishizawa M, Takahashi H, Onodera O
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Journal Title
J Neurol Neurosurg Psychiatry
Volume: 84
Pages: 398-401
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Alteration of POLDIP3 splicing associated with loss of function of TDP-43 in tissues affected with ALS2012
Author(s)
Shiga A, Ishihara T, Miyashita A, Kuwabara M, Kato T, Watanabe N, Yamahira A, Kondo C, Yokoseki A, Takahashi M, Kuwano R, Kakita A, Nishizawa M, Takahashi H, Onodera O
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Journal Title
PLoS One
Volume: 7
Pages: e43120
DOI
Peer Reviewed
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