2012 Fiscal Year Research-status Report
超微形態と独創的実験系によるＲＴＴ症候群の脳ならび他臓器の病態解明
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24791076
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Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
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| Research Institution | Kagoshima University |
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Principal Investigator |
入江 理恵 鹿児島大学, 医歯(薬)学総合研究科, 助教 (90381178)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2014-03-31
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| Keywords | Rett / MeCP2 / 超微形態 |
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| Research Abstract |
意義と重要性
我々は、すでに維持しているRett症候群(RTT)の原因遺伝子であるMeCP2遺伝子を欠損させたマウスにて、脳以外のある他臓器での新規の表現型異常を見出したところであり（未発表）、さらに本年度は、脳ならびにこの候補の他臓器に関し、電顕を駆使して超微構造・分子解析を行った。さらに、ウィルスベクターを利用して、その候補の他臓器の培養細胞のMeCP2のノックダウンを試み、その形態的・機能的変化を明らかにしているところである。このように革新的なin vitroとin vivoモデルでの実験系を機能的に融合した斬新な研究手法で、RTTの病態（脳並びに脳外臓器）とMeCP分子機能の解明に迫る。
MeCP2-/y雄マウスは、雄野生型(X+/Y)と雌Hetero(X+/X-)を交配・維持している。雄野生型、雄Hemi（X-/Y)、雌野生型(X+/X+)、雌Hetero が、いずれも1/4の確立で生じる。雄Hemi（X-/Y)マウスの脳あるいは他臓器(表現型異常のある候補臓器を絞っている)を採取し、各臓器の肉眼的所見や重量の他、凍結固定後に臓器特異的な蛋白あるいは遺伝子発現について光顕的、免疫電顕的あるいは免疫組織化学的、分子生物学的に解析し、MeCP2遺伝子が組織形成に関してどのような役割を持つのか、ある仮説をたてた。またこの候補臓器の機能とRTTで顕著な神経系異常への関与に注目し、MeCP2遺伝子が候補臓器の細胞の機能の変化(他の蛋白や産生物質へ及ぼす影響)をin vivoで比較している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、Rett症候群(RTT)の原因遺伝子であるMeCP2遺伝子を欠損させたマウスの臓器(脳ならびに表現型異常のある候補臓器)の肉眼的所見や重量計測の後、光学顕微鏡用組織標本の作製及び電子顕微鏡試料作製を行いサンプルを多数確保した。また、臓器を凍結固定し、臓器特異的な蛋白あるいは遺伝子発現について比較解析するための検体数を十分に確保した。
マウス所見で表現型に異常が見られた臓器の培養細胞についてRNAi法を用いてMeCP2をノックダウンし、形態形成及び生理活性への関与を比較するために、遺伝子組み換え技術によりshRNAを搭載したウィルスベクターを作製し、その臓器の培養細胞に感染させ、MeCP2をダウンレギュレートさせた安定細胞株を樹立した(Western blottingで確認)。
本年度はデータを揃えるための検体数確保や準備に費やしたため、おおむね順調に計画は進行していると判断している。
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| Strategy for Future Research Activity |
MeCP2-/y雄マウス表現系に超微構造的な差異が見られた臓器の正常培養細胞と、ウィルスベクターを作製して、RNAi法を用いてMeCP2をダウンレギュレートさせた安定細胞株を樹立したため(Western blottingで確認)、MeCP2ノックダウン細胞と、野生型細胞の臓器特異的な産生物質あるいは生理活性または形態を比較することによって、MeCP2遺伝子の、細胞あるいは臓器特異的な機能への関与をin vitroで生理活性について(HPLC、ELISA等)、及び免疫組織細胞化学的・超微形態的に解析・比較する。
次に、MeCP2遺伝子が生体内で組織形成に関してどのような役割を持つのか、あるいは他の蛋白や産生物質への影響をin vivoで比較する。つまり、MeCP2-/y雄マウスと同様の方法で、臨床治療への応用として真のRTTモデルマウスである(MeCP2+/-雌マウス；Hetero)組織を採取して、脳あるいは他臓器を採取し、各臓器の肉眼的所見や重量の他、凍結固定後に臓器特異的な蛋白あるいは遺伝子発現について光顕的、免疫電顕的あるいは免疫組織化学的、分子生物学的に解析し、MeCP2遺伝子が組織形成に関してどのような役割を持つのか、あるいはMeCP2遺伝子が他の蛋白や産生物質へ及ぼす影響をin vivoで比較する。
培養細胞レベル（in vitro）と組織細胞レベル（in vivo）の両方で、MeCP2遺伝子欠損によって起こる形態的・機能的変化の解析をを同時並行して得られた研究成果をまとめ、発生学関係の国際雑誌ならびに日本組織細胞化学会等の国内(国際)学会にて発信する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
大型機器は新規に購入する予定は今のところなく、組織培養や分子生物学的な実験に使用する試薬や解析に使用する予定であり、また成果報告のための学会報告に充てる予定である。
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