ＭａｓｓＡＲＲＡＹを用いたマウス腫瘍特異的遺伝子のヒト神経芽腫における網羅的解析

2012 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 24791893
• Research Institution: Nihon University
• Principal Investigator: 大橋 研介 日本大学, 医学部, 助手 (10526065)
• Project Period (FY): 2012-04-01 – 2014-03-31
• Keywords: 小児外科 / 小児固形腫瘍 / メチル化

Research Abstract

1. 新規腫瘍特異的メチル化変異領域のヒト相同領域の検索
我々は既にマウスにおいてMeDIP法とMicroarrayを組み合わせた手法によりDNAメチル化状態と遺伝子発現状態の網羅的解析を行っている。これによりマウス腫瘍特異的DNAメチル化変化領域を特定し、その近傍で遺伝子発現が亢進している20領域と遺伝子発現が低下している1領域を確認している。これは前者が癌遺伝子、後者が癌抑制遺伝子の候補遺伝子であると考えられる。これらの遺伝子のヒト相同領域をUCSC Genome Bioinformatics Website(http://genome.ucsc.edu/index.html)で検索した。その結果、21の遺伝子のうち相同領域がないものが4つ、既にヒト神経芽腫で遺伝子発現解析の報告があるものが1つあり、これらを解析対象から除外した。
2. 神経芽腫細胞株を用いた遺伝子発現解析とDNAメチル化解析
上記の16の候補遺伝子のプライマーを作成し、Real-time RT-PCR法で神経芽腫細胞株（NB1、NB9、NB69、SK-N-SH）における定量的遺伝子発現解析を行った。コントロールとしてヒト正常副腎組織を用いた。その結果、16の候補遺伝子のうち発現に有意差を認めたものが7つであった。これら7つの遺伝子を定量的メチル化変化解析の対象とし、The METHPRIMER program(http:www.urogene.org/methprimer/index1.html）を用いてMassARRAY Epityperに使用するプライマーを作成した。今年度はMassARRAY Epityperを用いて上記16の候補遺伝子のDNAメチル化解析を行っていく。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

細胞培養の際にコンタミ等の大きな問題なく順調に培養できた。培養した細胞からのRNA抽出やcDNAへの変換にあたってはキットを利用し時間短縮を図った。また、作製したプライマーは数が多かったが、おおむね一度で問題なく働くことが確認できた。そのプライマーを用いたリアルタイムRT-PCRも安定して結果を得られた。

Strategy for Future Research Activity

絞り込まれた7つの遺伝子においてMassARRAY Epityper法にて定量的メチル化変化解析を行う。有意差を認めた遺伝子に対してWestern Blotting法にてタンパク発現解析を行う。その後、その遺伝子の定常発現株を作製し、PIポリアミド、siRNAを用いて機能解析を行う予定である。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

該当なし。