エンドトキシン血症肺毛細血管モデルにおけるヒスタミン受容体発現と血管透過性の関係

2012 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 24791956
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Research Institution: Hyogo Medical University
• Principal Investigator: 尾迫 貴章 兵庫医科大学, 医学部, 助教 (30573844)
• Project Period (FY): 2012-04-01 – 2014-03-31
• Keywords: 国際情報交換

Research Abstract

正常ヒト肺微小血管内皮細胞(高純度HMVEC-LBI細胞)は継代数1.5×10※5 cells/6cm dish、viability 90%以上を維持可能であった。専用の微小血管細胞培養用培地(E GM TM-2-MV BulletKit TM)を用い、6cm dishに播種した。毎日培地交換を行い80% confluent monolayerとなった時点で継代を行った。細胞のdoubling timeを求め継代可能回数を算定したところ、transwell播種までの実験に最適な継代数は２回であった。尚、transwell上のconfluent monolayerの確認はMillicell ERS-2(Millipore)によりアピカル側とバソラテラ ル側の電気抵抗値を測定することで確認した。
小血管内皮細胞培地キット-2(5%-FBS; EGMTM-2-MV-BulletKit TM))を用いてtranswell(fibronectin-coated 3μm pore size 24 well)内にてconfluent monolayerまで培養したHMVEC-LBIを標準モデルとした。標準モデルにLPS O111:B4 (0.1-10 μg/mL)を添加したものを対照モデルAとし、各モデルにおけるH1R/H2R発現量をLPS添加2・4・8・12・24時間後にリアルタイムPCR法にて解析した。同時に、FITC標識したアルブミン(最終濃度:1 mg/mL)を加え8時間経過した後 、well下層へのアルブミン漏出を蛍光測定法にて解析した。同様のモデルを作成し、細胞間tight junctionの解離の程度を蛍光免疫染色(DAPI,VE-Cadherin,F-actin)にて観察した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

血管透過性亢進の程度を測るモデルであるアルブミン標識を用いたtranswell下層へのアルブミン漏出と、LPS添加後の経時的ヒスタミン受容体mRNA測定は実施できていない。HMVEC-LBIの増殖速度やviabilityの確認、confluent monolayer形成までに要する時間と電気抵抗測定の関係、実際にconfluent monolayerとなったか否かの染色による確認、蛍光染色に用いる試薬濃度の設定に時間を要した事と、ヒスタミン受容体mRNAプライマー設定に不備が重なったためである。

Strategy for Future Research Activity

基礎および予備実験はほぼ完了している。平成24年度予定の研究のうち残る課題は、アルブミン標識による血管透過性の評価を残すのみである。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

平成24年度の残りの課題を遂行するために、今年度の残研究費は次年度に必要である。それらを早期に終え、次年度の研究を行う予定である。