2013 Fiscal Year Research-status Report

エンドトキシン血症肺毛細血管モデルにおけるヒスタミン受容体発現と血管透過性の関係

Research Project

Project/Area Number	24791956
Research Institution	Hyogo Medical University
Principal Investigator	尾迫貴章兵庫医科大学, 医学部, 助教 (30573844)
Keywords	ヒスタミン
Research Abstract	正常ヒト肺微小血管内皮細胞(高純度HMVEC-LBI細胞)は継代数1.5×10※5 cells/6cm dish、viability 90%以上を維持可能であった。専用の微小血管細胞培養用培地(E GM TM-2-MV BulletKit TM)を用い、6cm dishに播種した。毎日培地交換を行い80% confluent monol ayerとなった時点で継代を行った。細胞のdoubling timeを求め継代可能回数を算定したところ、transwell播種までの実験に最適な継代数は2回であった。尚、transwell上のconfluent monolayerの確認はMillicell ERS-2(Millipore)によりアピカル側とバソラテラル側の電気抵抗値を測定することで確認した。小血管内皮細胞培地キット-2(5%-FBS; EGMTM-2-MV-BulletKit TM))を用いてtranswell(fibronectin-coated 3μm pore size 24 well) 内にてconfluent monolayerまで培養したHMVEC-LBIを標準モデルとした。標準モデルにLPS O111:B4 (0.1-10 μg/mL)を添加したものを対照モデルAとし、各モデルにおけるH1R/H2R発現量をLPS添加2・4・8・12・24時間後にリアルタイムPCR法にて解析した。同時に、F ITC標識したアルブミン(最終濃度:1 mg/mL)を加え8時間経過した後、well下層へのアルブミン漏出を蛍光測定法にて解析した。同様のモデルを作成し、細胞間tight junctionの解離の程度を蛍光免疫染色(DAPI,VE-Cadherin,F-actin)にて観察した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 4: Progress in research has been delayed. Reason 平成25年度は、血管内皮透過性亢進の分析を蛍光標識を用いて行ったのちに、siRNAを用いた透過性亢進阻害作用を検討する予定であった。そして、その結果を国内外の学会において発表する予定であった。しかし血管透過性亢進の分析結果が不均一であったため、予備実験による実験系の確認・再確立に時間を費やさざるを得ず、実験計画に遅れが生じた。
Strategy for Future Research Activity	一年間の延長申請をおこない、了承された。次年度は、siRNAを用いた透過性亢進阻害作用と国内外学会での発表を次年度に行うこととし、遅延している実験の実施に充てることとしたい。尚、蛍光標識を用いた透過性亢進分析実験系は、現時点でほぼ確立されている。
Expenditure Plans for the Next FY Research Funding	平成25年度は、血管内皮透過性亢進の分析を蛍光標識を用いて行ったのちに、siRNAを用いた透過性亢進阻害作用を検討する予定であった。そして、その結果を国内外の学会において発表する予定であった。しかし血管透過性亢進の分析結果が不均一であったため、予備実験による実験系の確認・再確立に時間を費やさざるを得ず、未使用額が生じた。上記事由により、siRNAを用いた透過性亢進阻害作用と国内外学会での発表を次年度に行うこととし、未使用額はその経費に充てることとしたい。尚、蛍光標識を用いた透過性亢進分析実験系は、現時点でほぼ確立されている。