2013 Fiscal Year Annual Research Report
In vivo, in situ突然変異検出系を用いた環境および放射線リスク評価
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25220102
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Grant-in-Aid for Scientific Research (S)
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| Research Institution | Radiation Effects Research Foundation |
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Principal Investigator |
野田 朝男 公益財団法人放射線影響研究所, 遺伝学部, 副部長(研究員) (40294227)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
濱崎 幹也 公益財団法人放射線影響研究所, 遺伝学部, 研究員 (80443597)
三谷 啓志 東京大学, 大学院新領域創成科学研究科, 教授 (70181922)
藤堂 剛 大阪大学, 医学系研究科(研究院), 教授 (90163948)
立花 章 茨城大学, 理学部, 教授 (20188262)
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| Project Period (FY) |
2013-05-31 – 2018-03-31
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| Keywords | 突然変異 / GFP / in vivo / 組織幹細胞 / 放射線 / リスク評価 |
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| Research Abstract |
本研究は、放射線や環境変異原の暴露によりモデル動物体内で生じる突然変異細胞をライブでとらえて観察し、個体レベルでのリスク評価に用いることを目標としている。突然変異細胞が組織の中で生きたまま光る（GFP蛍光等を発する）システムを遺伝子組換え（knock-inとtransgenic）で作製する作業をマウスで行った。特定遺伝子座の変異指標として、Ｘ染色体上のHPRT遺伝子の部分重複からの復帰変異(reversion)にて細胞がGFP陽性になるマウス系統をES細胞のknock-inにより作製した。このマウス（HPRTdupGFP）を用いて、放射線被ばくによる各種臓器（肝臓や膵臓、小腸など）内での体細胞突然変異誘発リスクについて評価実験を行った。胎児被ばくの影響実験も開始した。メダカでも同様なシステム構築を開始した。体内で生じる突然変異細胞のゲノム変異解析、変異発生率に影響を与える遺伝的要因を明らかにする目的で、メダカにて特定遺伝子破壊系統を複数作製し、変異検出モデルメダカとの交配の準備段階に入った。培養幹細胞、組織幹細胞の突然変異特性を解析するシステムを構築した。さらに、前進性突然変異(forward mutation)やがん遺伝子のLOHにより細胞が光るモデル動物の作製も開始した。これら全体の研究を統括して、個体レベルでの体細胞突然変異の発生をマクロおよびミクロでとらえる本グループ研究の全体像が定まってきた。第一段階の研究成果を論文としてまとめる作業に入った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
体内で生じる突然変異を生きたまま、ライブでとらえる（突然変異細胞が光る）事が可能なマウス系統の作製に成功した。このマウスでは少なくとも、肝臓、膵臓、小腸、肺、脾臓リンパ球、甲状腺上皮、精原細胞などで生じた突然変異細胞が蛍光顕微鏡下と凍結組織切片で観察できることが確認された。従って、このモデル動物システムを用いれば放射線や環境変異原暴露による各種臓器、組織が被る突然変異リスク、引いては発がんリスクを推定できると期待できる。同様なモデル動物をメダカで作製するためのターゲットベクターも完成した。今後に向けて、第２世代のモデル動物作製も開始した。これまで作製している突然変異検出システムは復帰型突然変異を指標としたものであり、変異スペクトルが限定されることから、次世代システムでは前進性突然変異(forward mutation)を検出する系としたいと考えている。メダカでは、p53のLOH発生に依存した癌の発生をモニターするシステムが実用段階に入った。
メダカにTALEN, CRISPR技術を導入してDNA polymeraseやDNA修復酵素遺伝子を網羅的に破壊した変異個体系統を作製しつつある。これまでにATM, p53, DNA-PKcs, Rev1, Msh2欠損メダカができた。これらの変異が個体内の体細胞突然変異にどの様に影響を及ぼすか、今後の解析の土台ができた。また、飼育温度や浸透圧などの環境要因の影響も解析を始めた。
幹細胞と分化した体細胞で放射線誘発突然変異の特性に違いがあるか、解析実験を開始した。以上より、５年計画の初年度としては順調であることを２月の班会議で確認し、今後の協力体制について議論した。
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| Strategy for Future Research Activity |
1. 発がんの標的組織として知られる肝臓や膵臓、腸、甲状腺などについて放射線被ばくのリスク評価の解析実験を継続する。線量および線量率効果についての実験も計画する。小腸上皮の変異は、クリプト内幹細胞の変異が由来であり、組織幹細胞の変異とそれの絨毛への広がりが可視化されるので、放射線誘発突然変異細胞の体内動態を直接観察できることになる。精巣内の精原細胞突然変異の観察システムをこれから確立する。精原細胞マーカーCD9, CD322で標識される細胞集団の変異頻度を測定する。これにより、被ばくによる生殖細胞への影響が評価できる。
2. 胎児被ばく、発達期被ばくにより成体となった後の各種組織、臓器に見られる体細胞突然変異頻度の測定を行う。
3. HPRTdupGFPベクターをメダカ受精卵に導入することにより上記システムをメダカ個体でも作製する。p53のLOHが起こるとメラノーマが発生するメダカシステムを完成させ、放射線被ばくの影響を個体レベルで観察する。DNA修復系遺伝子が欠損したメダカ系統と交配して、in vivo 突然変異の高感度測定システムを作製する。体の中で生じた突然変異細胞集団について全ゲノムレベルでの解析を試み、ゲノムの不安定性の獲得の有無を検証する。
4. 幹細胞と分化した体細胞で起こる突然変異を比較して、変異のメカニズムの相違点を明らかとする。
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[Journal Article] Fetal Irradiation of Rats Induces Persistent Translocations in Mammary Epithelial Cells Similar to the Level after Adult Irradiation, but not in Hematolymphoid cells.2014
Author(s)
Nakano, M., Nishimura, M., Hamasaki, K., Mishima, S., Yoshida, M., Nakata, A., Shimada, Y., Noda, A., Nakamura, N., Kodama, Y.
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Journal Title
Radiation Research
Volume: 181
Pages: 172-176
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] p53-Dependent suppression of genome instability in germ cells2014
Author(s)
Otozai, S., Ishikawa-Fujiwara, T., Oda, S., Kamei, Y., Ryo, H., Sato, A., Nomura, T., Mitani, H., Tsujimura, T., Inohara, H., Todo, T.
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Journal Title
Mutation Research
Volume: 760
Pages: 24-32
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Regular heartbeat rhythm at the heartbeat initiation stage is essential for normal cardiogenesis at low temperature2014
Author(s)
Watanabe-Asaka, T., Sekiya, Y., Wada, H., Yasuda, T., Okubo, I., Oda, S., Mitani, H.
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Journal Title
BMC Developmental Biology
Volume: 14
Pages: 1-13
DOI
Peer Reviewed
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[Presentation] Progerin, the causal protein for the accelerated premature aging in humans, enhances levels of unrepaired DNA damages following genotoxic stress insult2013
Author(s)
Noda, A., Mishima, S., Hirai, Y., Hamasaki, K., Mitani, H., Haga, K., Kiyono, T., Nokamura, N., Kodama, Y.
Organizer
Environmental Mutagenesis and Genomics Society USA
Place of Presentation
Hyatt Regency, Monterey, CA (USA)
Year and Date
20130921-20130925
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