超高速ゲノム解読に基づくマウス生殖細胞誘発変異検出と微量変異原リスク評価法の確立

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 25241016
• Research Institution: Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 権藤 洋一 国立研究開発法人理化学研究所, バイオリソースセンター, チームリーダー (40225678)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 姫野 龍太郎 国立研究開発法人理化学研究所, 情報基盤センター, センター長 (60342838) ; 茶野 徳宏 滋賀医科大学, 医学部, 准教授 (40346028) ; 舘田 英典 九州大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (70216985) ; 大野 みずき 九州大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (70380524)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 突然変異検出 / マウスゲノム / 次世代シーケンシング / 遺伝学 / 生殖細胞系列突然変異 / ビッグデータ / 環境影響評価 / ゲノム機能

Outline of Annual Research Achievements

微量変異原の比較評価に必須な「ゼロ変異原値」を求めるための、自然発生突然変異検出解析が計画を上回って進んだ。劣性有害変異にも選択淘汰なしに足かけ5世代蓄積した独立な８個体のWGSビッグデータから、SNVコールが完了した。検証可能な全SNV候補にPCRプライマーを整備し、大家系のいつどこで変異が生じたかも含め実験検証を進めた（担当権藤）。
今年度はさらに小規模で高速簡便に遺伝的背景の違いまで比較検討できる、兄妹交配を活用した自然発生突然変異解析システムを独自に発案し2015年度ゲノム支援課題として採択された。比較用コントロール系統であるC57BL/6JJclサンプルに加え、高発がん系統である129近交系サンプルと低発がん系統であるMSM/Ms近交系サンプルそれぞれ初代と末代2個体ずつ全ゲノムシーケンシングが完了した(担当権藤)。
すべてのWGSビッグデータを国立遺伝研DDBJに登録し、さらに、変異情報など加味したメタデータベースプラットフォームも理研情報基盤センターに整備した(担当姫野，権藤)。
また、SNV検出大規模解析の過程で、マウスゲノム参照配列の大きな問題があることを発見し、参照配列を抜本的に見直すための新たなAMED NBRP課題が、本研究から発展して採択された(代表権藤)。
突然変異の個体への影響の解析においても、新たに、cFlip-l変異(Shibata et al. 2015) のストップコドンがTrpコドンに置換したマウスでは46残基さらに翻訳され、ホモ接合マウスは肝細胞のアポトーシスによって胎生13.5日で致死となることを明らかにした。またNcs-1遺伝子のP144Sホモ接合マウスが、自発的探索学習に異常をきたすモデルとなることを示した(Mun et al. 2015)。また脳線条体で高発現するSTEP遺伝子のC230ナンセンス変異ホモ接合マウスでは、モルヒネによる急性精神行動異常が減衰することを発見した(Kim et al. 2015)。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

独立に変異蓄積した8家系8個体の全ゲノムシーケンシング(WGS)が、昨年度、新学術領域ゲノム支援課題として採択され、申請当初エキソーム50Mb対象とした計画から60倍の全ゲノム3000Mbが対象となり予想を遥かに上回る規模となり今年度すでに１塩基変異(SNV)候補の実験検証に入った。さらに、小規模で簡便高速に多家系の変異検出ができる解析系を独自に着想し、今年度も新規のゲノム支援課題として採択され、すでに6ゲノム分のWGSビッグデータを得た。このデータから高発がん/低発がん系統といった遺伝的背景の違いにおける自然発生突然変異解析が当初計画をさらに上回って進んだ。
また、本研究から「あり得ないSNV」が多数検出され、マウスゲノム参照配列そのものに大きな問題があることを明らかにし、AMED NBRPゲノム情報等整備プログラムに申請し、C57BL/6JJclマウス近交系ゲノムの抜本的な見直し研究課題「１分子長鎖再解読に基づく標準マウスゲノム配列および構造決定と公開」（代表権藤）が採択された。このように、本研究そのものが計画以上に進むだけでなく融合的分野研究へと大きく発展した。
ヒトやマウスなど様々な生物種において、次世代シーケンサーを活用した自然発生突然変異解析が進み成果も報告されているが、変異検出の普遍的共通基盤である参照ゲノム配列に、マウス参照配列でさえ大きな問題があったという事実は、世界的に進んでいる数10万人規模の疾患原因遺伝子探索など変異検出解析の分野全体を揺るがす可能性がある。また、本研究の一連の成果とゲノム参照配列の問題提起は、単に、変異検出解析分野に留まらず、PCRプライマー設計といった基本実験から、近年急速に利用が高まり将来的には遺伝子治療にも応用可能と期待されている「ゲノム編集」やRNAseq、メチルseq、ChIPseqといった「参照配列を必須とするすべての実験解析」にも大きな波及効果をもたらす研究成果となる可能性も高まった。

Strategy for Future Research Activity

本研究最終年度にあたり、まず、C57BL/6JJcll系統に、高発がん系統、低発がん系統との比較も含めた世界標準となるほ乳類ゲノムにおける突然変異率およびスペクトルの高精度な解析結果を論文発表する。この解析には、2015年度新たに採択されたAMED NBRP研究課題「１分子長鎖再解読に基づく標準マウスゲノム配列および構造決定と公開」（代表権藤）でde novo assemblyされた高精度なC57BL/6JJclプラチナゲノム参照配列を用いることで達成する。
また、ゲノム情報に留まらず、C57BL/6JJclの網羅的トランスクリプトームデータも解析公開し、遺伝子発現プロファイル面でも世界標準を本研究から発展させて発表する。この一連の成果を、シーケンシング生データから、ゲノム参照配列、変異情報、多型情報、トランスクリプトーム情報と、すべて日本から世界に発信するため、国立遺伝学研究所DDBJに登録するとともに、さまざまな情報を世界中から付加更新できるメタデータベース公開のための基盤プラットフォームも理研情報基盤センター(姫野センター長)との連携で構築整備したので、実装し公開を進めていく。
さらに、本研究成果を基盤として、実験生命科学分野から情報理論分野にいたるまでさまざまな異分野間の融合研究を促進する国際コンソーシアムへの発展も視野にいれる。とくに、ゲノム全体の変異や多型と、その遺伝子発現プロファイルまで網羅的に貸席することが可能となるため、世界中で総数百万人規模のGenomewide Association Studies(GWAS)でもまだ未着手の「多因子複合疾患」の遺伝的要因の検出同定と病態解明の基盤を本研究から萌芽発展を試みる。この多因子複合形質の情報科学とも融合した実験解析法の確立は、新しい実験進化学や比較ゲノミクス/オミクスといったパラダイムシフトをもたらすような基礎研究へも展開可能となるはずである。

Research Products

• [Journal Article] STEP signaling pathway mediates psychomotor stimulation and morphine withdrawal symptoms, but not for reward, analgesia and tolerance. (2016)
  • Author(s): Kim YJ, Kang Y, Park HY, Lee JR, Yu DY, Murata T, Gondo Y, Hwang JH, Kim YH, Lee CH, Rhee M, Han PL, Chung BH, Lee HJ, Kim KS
  • Journal Title: Experimental and Molecular Medicine Volume: 48 Pages: e212(1-10)
  • DOI: doi: 10.1038/emm.2016.1
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Self-directed exploration provides a Ncs1-dependent learning bonus (2015)
  • Author(s): Mun HS, Saab BJ, Ng E, McGirr A, Lipina TV, Gondo Y, Georgiou J, Roder JC
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 5 Pages: 17697(1-13)
  • DOI: doi: 10.1038/srep17697
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Degradation of Stop Codon Read-through Mutant Proteins via the Ubiquitin-Proteasome System Causes Hereditary Disorders. (2015)
  • Author(s): Shibata N, Ohoka N, Sugaki Y, Onodera C, Inoue M, Sakuraba Y, Takakura D, Hashii N, Kawasaki N, Gondo Y, Naito M
  • Journal Title: The Journal of Biological Chemistry Volume: 290 Pages: 28428-28437
  • DOI: doi: 10.1074/jbc.M115.670901
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Bcl11b SWI/SNF-complex subunit modulates intestinal adenoma and regeneration after γ-irradiation through Wnt/β-catenin pathway. (2015)
  • Author(s): Sakamaki A, Katsuragi Y, Otsuka K, Tomita M, Obata M, Iwasaki T, Abe M, Sato T, Ochiai M, Sakuraba Y, Aoyagi Y, Gondo Y, Sakimura K, Nakagama H, Mishima Y, Kominami R
  • Journal Title: Carcinogenesis Volume: 36 Pages: 622-631
  • DOI: doi: 10.1093/carcin/bgv044
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Genetics, mutagenesis and genomics with standardized mouse inbred strains. (2015)
  • Author(s): Gondo Y
  • Organizer: Fudan University School of Pharmacy Seminar
  • Place of Presentation: Fudan University, Shanghai, China
  • Year and Date: 2015-12-17
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] フレームシフト変異下流からの翻訳再開によるGLI3タンパク質発現 (2015)
  • Author(s): 牧野茂、福村龍太郎、権藤洋一
  • Organizer: 第38回日本分子生物学会年会 第88回日本生化学会大会 合同大会（BMB2015）
  • Place of Presentation: 神戸国際会議場（兵庫県神戸市）
  • Year and Date: 2015-12-03
• [Presentation] IonProtonシーケンサーを用いたエクソーム解析によるマウスENU誘発突然変異のカタログ化 (2015)
  • Author(s): 福村龍太郎、小瀧逸人、牧野茂、石塚祐一、中井祐治、権藤洋一
  • Organizer: 第38回日本分子生物学会年会 第88回日本生化学会大会 合同大会（BMB2015）
  • Place of Presentation: 神戸国際会議場（兵庫県神戸市）
  • Year and Date: 2015-12-01
• [Presentation] 標準マウス系統C57BL/6Jにおける自然発生突然変異の解析法の確立 (2015)
  • Author(s): 権藤洋一、福村龍太郎、石塚祐一、小瀧逸人、牧野茂、森一樹、久原哲、豊田敦、藤山秋佐夫
  • Organizer: 第38回日本分子生物学会年会 第88回日本生化学会大会 合同大会（BMB2015）
  • Place of Presentation: 神戸国際会議場（兵庫県神戸市）
  • Year and Date: 2015-12-01
• [Presentation] マウス全エキソーム解析によるENU誘発生殖細胞変異スペクトルの解析 (2015)
  • Author(s): 増村健一、鵜飼明子、豊田尚美, 権藤洋一, 能美健彦, 本間正充
  • Organizer: 日本環境変異原学会第44回大会
  • Place of Presentation: 九州大学（福岡県福岡市）
  • Year and Date: 2015-11-27 – 2015-11-28
• [Presentation] Experimental evolutionary study based on big data of mouse germline mutations from ENU mutagenesis. (2015)
  • Author(s): Oota S, Fukumura R, Saitou N, Gondo Y
  • Organizer: The 29th International Mammalian Genome Conference (IMGC2015)
  • Place of Presentation: Yokohama Port Memorial Hall, Yokohama, Kanagawa, Japan
  • Year and Date: 2015-11-11
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Production of a truncated protein from the Gli3 gene with a frameshift mutation, which is introduced by the CRISPR/Cas9 system (2015)
  • Author(s): Makino S, Gondo Y
  • Organizer: The 29th International Mammalian Genome Conference (IMGC2015)
  • Place of Presentation: Yokohama Port Memorial Hall, Yokohama, Kanagawa, Japan
  • Year and Date: 2015-11-10
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Needs of fundamental revision of mouse genome reference sequences (2015)
  • Author(s): Gondo Y, Mori K, Fukumura R, Toyoda A, Oota S, Takada T, Himeno R, Shiroishi T, Kuhara S, Fujiyama A
  • Organizer: The 29th International Mammalian Genome Conference (IMGC2015)
  • Place of Presentation: Yokohama Port Memorial Hall, Yokohama, Kanagawa, Japan
  • Year and Date: 2015-11-10
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] ENU mutation cataloging in the RINEN ENU mutant mouse library using whole exome analysis with Ion Proton sequencer. (2015)
  • Author(s): Fukumura R, Kotaki H, Makino S, Ishitsuka Y, Nakai Y, Gondo Y
  • Organizer: The 29th International Mammalian Genome Conference (IMGC2015)
  • Place of Presentation: Yokohama Port Memorial Hall, Yokohama, Kanagawa, Japan
  • Year and Date: 2015-11-09
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Detection of spontaneous mutations in mammalian genomes (2015)
  • Author(s): Gondo Y
  • Organizer: Biological & Medical Science based on Physics: Radiation and Physics, Physics on Medical Science, Modeling for Biological System
  • Place of Presentation: Kyoto University, Kyoto, Japan
  • Year and Date: 2015-11-05
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] βカテニン遺伝子の点突然変異と不妊 (2015)
  • Author(s): 権藤洋一
  • Organizer: 日本人類遺伝学会第60回大会
  • Place of Presentation: 京王ブラザホテル（東京都新宿区）
  • Year and Date: 2015-10-15
• [Presentation] ゲノム解析の基盤となるゲノムDNA参照配列の再検討 (2015)
  • Author(s): 権藤洋一
  • Organizer: 日本遺伝学会第87回大会
  • Place of Presentation: 東北大学（宮城県仙台市）
  • Year and Date: 2015-09-26
• [Presentation] Gli転写因子の可視化の試み：CRISPR/CasシステムによるGli3遺伝子のノックダウン (2015)
  • Author(s): 牧野茂、権藤洋一
  • Organizer: 日本遺伝学会第87回大会
  • Place of Presentation: 東北大学（宮城県仙台市）
  • Year and Date: 2015-09-26
• [Presentation] Experimental evolutionary study based on big data of mouse germline mutations from ENU mutagenesis. (2015)
  • Author(s): Oota S, Fukumura R, Gondo Y
  • Organizer: 日本遺伝学会第87回大会
  • Place of Presentation: 東北大学（宮城県仙台市）
  • Year and Date: 2015-09-25
• [Presentation] マウスにおける自然発生突然変異の蓄積と全ゲノムシーケンシングによる変異検出 (2015)
  • Author(s): 権藤洋一、福村龍太郎、石塚祐一、小瀧逸人、牧野茂、森一樹、久原哲、豊田敦、藤山秋佐夫
  • Organizer: 新学術ゲノム支援2015年度拡大班会議
  • Place of Presentation: 国立京都国際会館（京都府京都市）
  • Year and Date: 2015-08-27 – 2015-08-28
  • Invited
• [Presentation] 標準マウス系統C57BL/6Jにおける自然発生突然変異の検出と解析 (2015)
  • Author(s): 権藤洋一、福村龍太郎、石塚祐一、小瀧逸人、牧野茂、森一樹、久原哲、豊田敦、藤山秋佐夫
  • Organizer: 新学術ゲノム支援2015年度拡大班会議
  • Place of Presentation: 国立京都国際会館（京都府京都市）
  • Year and Date: 2015-08-27
  • Invited
• [Presentation] Mutagenesis and genomics in the mouse. (2015)
  • Author(s): Gondo Y
  • Organizer: The Fourth RIKEN BRC/Nanjing University MARC International Summer Intensive Course of the Mouse．
  • Place of Presentation: Nanjing University, Nanjing, China
  • Year and Date: 2015-07-27
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Gli転写因子の可視化の試みー培養細胞でのGli3遺伝子の不活性化 (2015)
  • Author(s): 牧野茂、権藤洋一
  • Organizer: 第29回モロシヌス研究会
  • Place of Presentation: かんぼの宿有馬（兵庫県神戸市）
  • Year and Date: 2015-07-03 – 2015-07-04
• [Presentation] SNV検出におけるIon ProtonとHiSEQの比較 (2015)
  • Author(s): 福村龍太郎、小瀧逸人、水口洋平、豊田敦、藤山秋佐夫、権藤洋一
  • Organizer: NGS現場の会第4回研究会
  • Place of Presentation: つくば国際会議場（茨城県つくば市）
  • Year and Date: 2015-07-02 – 2015-07-03
• [Presentation] マウスにおける自然発生突然変異の蓄積と新規変異の検出 (2015)
  • Author(s): 権藤洋一、福村龍太郎、石塚祐一、小瀧逸人、森一樹、久原哲、豊田敦、藤山秋佐夫
  • Organizer: NGS現場の会第4回研究会
  • Place of Presentation: つくば国際会議場（茨城県つくば市）
  • Year and Date: 2015-07-02 – 2015-07-03
• [Presentation] ゲノム時代における遺伝学のこれから (2015)
  • Author(s): 権藤洋一
  • Organizer: 神奈川県生物教育研究会総会
  • Place of Presentation: 横浜市立大学（神奈川県横浜市）
  • Year and Date: 2015-06-20
  • Invited
• [Presentation] Amplicon Sequence解析を用いたマウス系統の高速ジェノタイピング (2015)
  • Author(s): 小瀧逸人、福村龍太郎、権藤洋一
  • Organizer: 第62回日本実験動物学会総会
  • Place of Presentation: 京都テルサ（京都府京都市）
  • Year and Date: 2015-05-28
• [Presentation] Influence of Oxidative DNA Damage on the Rate of Somatic and Germline Mutation (2015)
  • Author(s): Ohno M, Takano N, Sakumi K, Fukumura R, Iwasaki Y, Ikemura T, Gondo Y, Nakabepppu Y, Nakatsu Y, Tsuzuki T
  • Organizer: 15th International Congress of Radiation Research (ICRR2015)
  • Place of Presentation: Kyoto International Conference Center,Kyoto, Japan
  • Year and Date: 2015-05-27
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Approach for gene interaction analysis by RIKEN ENU-based gene-driven mutagenesis system. (2015)
  • Author(s): Fukumura R, Kotaki H, Makino S, Minakuchi Y, Toyoda A, Fujiyama A, Gondo Y
  • Organizer: The 11th International Workshop on Advanced Genomics (AGW11)
  • Place of Presentation: Hitotsubashi Hall, Chiyoda-ku, Tokyo, Japan
  • Year and Date: 2015-05-20 – 2015-05-22
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 次世代シーケンシングに基づく新しいマウス遺伝学の展開 (2015)
  • Author(s): 権藤洋一
  • Organizer: 東海医学会
  • Place of Presentation: 東海大学（神奈川県伊勢原市）
  • Year and Date: 2015-04-28
  • Invited
• [Presentation] New infertile model for the Mayer-Rokitansky-Kuster-Hauer syndrome (MRKH) (2015)
  • Author(s): Murata T, Makino S, Fukumura R, Kaneda H, Toki H, Wakana S, Noda T, Yamada G, Gondo Y
  • Organizer: IFFS/JSRM International Meeting 2015
  • Place of Presentation: Pacifico Yokohama, Yokohama, Japan
  • Year and Date: 2015-04-26
  • Int'l Joint Research
• [Remarks] 理化学研究所研究紹介バイオリソースセンター新規変異マウス研究開発チーム
  • URL: http://www.riken.jp/research/labs/brc/mutagen_genom/
• [Remarks] RIKEN Research BRC Mutagenesis and Genomics Team
  • URL: http://www.riken.jp/en/research/labs/brc/mutagen_genom/
• [Remarks] 理化学研究所バイオリソースセンター一般公開来て見てふれて
  • URL: http://rtcweb.rtc.riken.jp/openhouse27/27openhouse.pdf