人工制限酵素を用いたゲノム編集技術の開発とその応用

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 25250014
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 伊川 正人 大阪大学, 微生物病研究所, 教授 (20304066)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: CRISPR/Cas / 実験動物 / ノックアウト / 点変異 / ノックイン / 不妊

Outline of Annual Research Achievements

『目的』人工制限酵素という最新技術を申請者が得意とするレンチウイルスベクターやハプロイドES 細胞などと組み合わせ、任意の遺伝子改変を可能にするオンデマンドゲノム編集システムを開発する。さらに開発した遺伝子組換え技術・動物を用いて、社会問題にもなっている不妊・不育のメカニズム解明を目指す。なお開発した遺伝子組換え技術および動物は、公的機関を通して広く生命科学研究者に提供する。

『実施概要』本研究では以下の２つを大きな柱にして研究を進めている。
I.オンデマンドゲノム編集システムの開発：CRISPR/Casシステムを用いて個体レベルでの遺伝子改変技術の開発を進めている。これまでにCas9とsgRNAを共発現するプラスミドを受精卵の前核に注入する手法を開発し、100系統を超える精巣特異的発現遺伝子のノックアウトマウスを作製した。点変異やノックインなどの複雑な遺伝子改変については、ES細胞を用いることで効率的に実施できることを明らかにした。
II.生殖不全マウスの重点解析：区分Iで得られた遺伝子改変マウスについて、交配による妊孕性試験を行っている。その結果、10系統を超える雄性不妊マウス系統を樹立した。今後は、分子メカニズムの解明をスタートさせる。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

CRISPR/Casを用いた手法により、既に100系統を超える遺伝子破壊マウスの作製に成功し、さらに解析を始めた系統の内、10系統で雄性不妊の表現型が見られていることから、順調に進展していると判断した。

Strategy for Future Research Activity

単純な遺伝子破壊と異なり、点変異やノックインなどの複雑な遺伝子改変を受精卵で行うことは難しい。そこで複雑な遺伝子改変については、処理数を増やすことのできるES細胞を活用する予定である。

Research Products

• [Journal Article] NUCKS Is a Positive Transcriptional Regulator of Insulin Signaling (2014)
  • Author(s): Qiu B, Shi X, Wong ET, Lim J, Bezzi M, Low D, Zhou Q, Akincilar SC, Lakshmanan M, Swa HL, Tham JM, Gunaratne J, Cheng KK, Hong W, Lam KS, Ikawa M, Guccione E, Xu A, Han W, Tergaonkar V.
  • Journal Title: Cell Rep Volume: 7(6) Pages: 1876-86
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2014.05.030
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Effect of isolated AMP deaminase deficiency on skeletal muscle function (2014)
  • Author(s): Chenga j, Morisaki H, Sugimoto N, Dohi A, Shintani T, Kimura E, Toyama K, Ikawa M, Okabe M, Higuchi I, Matsuo S, Kawai Y, Hisatome I, Sugama T, Holmes E. W. , Morisaki T.
  • Journal Title: Molecular Genetics and Metabolism Reports Volume: 1 Pages: 51-9
  • DOI: 10.1016/j.ymgmr.2013.12.004
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Deletion of N-myc downstream-regulated gene 2 attenuates reactive astrogliosis and inflammatory response in a mouse model of cortical stab injury (2014)
  • Author(s): Takarada-Iemata M, Kezuka D, Takeichi T, Ikawa M, Hattori T, Kitao Y, Hori O.
  • Journal Title: J Neurochem Volume: 130(3) Pages: 374-87
  • DOI: 10.1111/jnc.12729
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Genome Editing in Mice Using CRISPR/Cas (2014)
  • Author(s): Young S, Baker M, Ikawa M.
  • Journal Title: Targeted Genome Editing Using Site-Specific Nucleases Volume: － Pages: 151-166
  • Peer Reviewed
• [Presentation] CRISPR/Casシステムが開く遺伝子改変マウスの未来 (2015)
  • Author(s): 伊川正人
  • Organizer: 第86回東海実験動物研究会
  • Place of Presentation: 岐阜大学（岐阜市）
  • Year and Date: 2015-03-28
  • Invited
• [Presentation] CRISPR/Cas システムを用いたマウスゲノム編集 (2014)
  • Author(s): 伊川正人
  • Organizer: 第62回日本ウイルス学会学術集会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜会議センター（横浜市）
  • Year and Date: 2014-11-12
  • Invited
• [Presentation] CRISPR/Casを用いたマウスゲノム編集と表現型解析 (2014)
  • Author(s): 伊川正人
  • Organizer: がん支援活動公開シンポジウム
  • Place of Presentation: 一橋講堂（東京都千代田区）
  • Year and Date: 2014-08-21
  • Invited
• [Presentation] CRISPR/CASシステムを用いたマウスゲノム編集 (2014)
  • Author(s): 伊川正人
  • Organizer: 第41回日本毒性学会学術年会
  • Place of Presentation: 神戸コンベンションセンター（神戸市）
  • Year and Date: 2014-07-04
  • Invited
• [Remarks] 研究室HP
  • URL: http://www.egr.biken.osaka-u.ac.jp/