2014 Fiscal Year Annual Research Report
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25251005
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| Research Institution | National Institute of Genetics |
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Principal Investigator |
荒木 弘之 国立遺伝学研究所, 細胞遺伝研究系, 教授 (20151160)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
日詰 光治 国立遺伝学研究所, 細胞遺伝研究系, 助教 (10378846)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | DNA複製 / 細胞周期 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
真核生物の染色体DNAの複製開始領域にはOrcが結合し、次にDNAヘリカーゼコアであるドーナツ状のMcm2-7ヘテロヘキサマーが２本鎖DNAを取り囲むようにロードされる。この際、一対のMcm2-7がN-末を向き合う形でロードされるので、ヘリカーゼは両方向に２本鎖DNAを１本鎖に解き、両方向性のDNA複製を保証する。しかし、Mcm2-7単独ではヘリカーゼ活性を示さず、Cdc45とGINSという２つの因子が加わって、初めて活性を示す。この両者のMcm2-7への結合に関与するSld3の構造と機能について解析を行った。
Sld3は中央部でCdc45, Mcm2-7と、N末側でSld7と、C末側でDpb11と結合する。Dpb11との結合は、Sld3のCDKによるリン酸化に依存し、この結合はGINSをMcm2-7にリクルートする。Sld3の中央部はCdc45-binding domain (CBD)として菱形状の構造をしていることを昨年明らかにしている。今期は、Sld7のN末半分とSld3のN末領域の結合した複合体とSld7のC末２量体の構造を決定した。その結果、２分子のSld3が２分子のSld7を介して逆平行に結合していることが示唆された。さらに、異なる部位に変異を持つSld3とSld7の複合体を精製し、in vitro複製系を用いて解析した。Sld3のCDBの変異やC末リン酸化部位の変異は単独では働かないが、CDBに変異を持つSld3 1分子とC末に変異を持つSld3 1分子をSld7で結合した複合体を精製すると野生型Sld3-Sld7と同様に働くことを見出した。このことは、Sld3-Sld7複合体内の２分子のSld3が協調して働いていることを示唆し、この構造が両方向性の複製開始に寄与している可能性がある。
精製ヒストンから再構成したクロマチンを用いた複製機構も平行して進めている。今期は、このクロマチンを用いてMcm2-7のローディングを調べた。現段階では、AFMによりロードされたMcm2-7を同定できる段階で、複製中間産物を解析する段階には至っていない。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Sld3の構造と機能について十分な進展があった。一方、クロマチン基質の複製反応については、まだ緒についたところである。全体としては、予定通りの進展と考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
精製タンパク質を用いたin vitro複製系がごく最近報告された。この系では、裸のDNAを基質として用いている。この精製系も使用できるようにし、タンパク質活性の詳細な解析とクロマチンを基質とした系の構築に邁進する。
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