2013 Fiscal Year Annual Research Report
ジンクフィンガーヌクレアーゼの遺伝子ノックアウト動物作製への実用化に関する研究
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25252056
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Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
内藤 邦彦 東京大学, 農学生命科学研究科, 教授 (20188858)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 人工ヌクレアーゼ / ZFN / CRISPR/Cas / 哺乳類卵 |
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| Research Abstract |
本研究はジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)の効率を高め、非特異的切断を抑制する方法を検討し、広く一般に実用化することを目的としており、その方法の一つとして、ZFNのDNA認識ドメインであるZinc finger (ZF)の個数を増やすことが考えられた。そこで、マウス胚の初期発生停止を引き起こすことが報告されている4fingerのZFNをモデルに、ZF数を増やし胚発生停止とゲノム改変効率に対する影響を検討した。
当研究室で確立された簡易・安価・迅速なZFNの作製法であるOLTA法およびその変法を用いて、ZF数を6 (Right)および7 (Left)へと延長することに成功した。これらをマウス前核期胚に顕微注入したところ、7fingerのLeft-ZFN実験区において発生停止が救済された。さらに、発生停止を起こす4fingerのZFNについて、DNA二本鎖切断(DSB)の指標となるHistone H2AXのリン酸化(γ-H2AX)により毒性を確認した結果、DSBが前核の広範囲に及んでおり、ゲノム中の複数のOff-targetに変異が見出された。一方、7fingerのZFNを導入した際には、γ-H2AXは見出されなかった。なお、6fingerのRight-ZFN実験区では、発生停止が救済されず、また7fingerのLeft-ZFN実験区において標的配列に変異が導入されたが、4finger 実験区の改変効率を上回ることはできなかった。以上の結果から、ZFNのZF数を延長することにより毒性を改善することは場合により可能だが、ゲノム改変率を劇的に改善することは難しいことが示唆された。
なお、2013年に新たな人工ヌクレアーゼとしてCRISPR/Cas系が報告され、当研究室もこれの作用確認を行ったところ、ZFNと比較し格段に高率が高く、また複数の遺伝子改変や大規模な遺伝子欠損も起こせ、次世代への伝達されることが明らかとなった。今後は人工ヌクレアーゼとしてはCRISPR/Cas系が主流になると考えられるため、当初の目的のZFNの部分をCRISPR/Cas系に置き換えて研究を遂行することとする。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
本年度のZFNに対する研究成果ではZF数を延長することにより毒性を改善することは場合により可能だが、ゲノム改変率を劇的に改善することは難しいことが示唆されており、一定の成果はあったものの、劇的なZFNの効率改善にはつながらなかった。この点ではやや遅れていることになる。一方、2013年に新たな人工ヌクレアーゼとしてCRISPR/Cas系が報告され、当研究室も哺乳類卵内で高発現するCas9のベクター作製に成功し、これの作用確認を行った。その結果、ZFNと比較し格段に効率が高くほぼ100％であること、また一度に複数の遺伝子改変が可能であること、同一染色体の10kbp以上離れた部位を標的とすることで間のDNAを削除でき大規模な遺伝子欠損も起こせること、さらに、これらの変異は次世代への伝達されることが明らかとなった。これらの報告は日本初のCRISPR/Cas系の報告であり、特に大規模な遺伝子欠損や、変異の次世代への伝達は世界初の報告である。当研究室で作製したCas9ベクターはAddgeneにデポジットされ、現在までに世界各国の23機関から取り寄せの要求が来ている。これらの成果は当初の計画を大きく上回るのもであり、総合して当初の計画以上に進展していると結論した。
なお、今後は人工ヌクレアーゼとしてはCRISPR/Cas系が主流になると考えられるため、当初の目的のZFNの部分をCRISPR/Cas系に置き換えて研究を遂行することとする。すなわちCRISPR/Cas系の最適化を図り、広く一般に実用化し、家畜、魚類のノックアウト個体の作製に資することを目的とする。
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| Strategy for Future Research Activity |
CRISPR/Cas系において遺伝子認識に用いる種々のガイドRNA (gRNA)を合成し、当研究室で開発した哺乳類卵に高発現するCas9のmRNAとgRNAをマウス胚およびブタ卵母細胞に顕微注入して、標的部位への変異導入効率、およびオフターゲット率を、それぞれT7エンドヌクレアーゼI アッセイ、および抗γH2AX 抗体の免疫染色により調べる。
上にも記したとおり当研究室では昨年の研究により、既にマウス胚において複数の遺伝子改変や大規模な遺伝子欠損も起こせ、次世代への伝達されることを明らかにしており、これらの報告はCRISPR/Cas系を用いた遺伝子改変動物作製の日本初の報告であり、大規模欠損や次世代への伝達は世界初の報告である。
本年度はこれを家畜卵に応用すること、およびマウス卵においてコンディショナルノックアウト動物の作製とノックイン動物の作製効率を高めることを目的とする。
家畜卵としてはブタ卵母細胞を用い、受精前の減数分裂過程でCRISPR/Cas系を作用させ、染色体の状態と遺伝子改変の関連を調べ、効率の改善にむけた濃度、作用時期の最適化を検討する。またオフターゲット率の低下にはCas9ニッカーゼの使用が有効であることをマウス胚ではすでに示しており、これをブタ卵にも応用する。
マウスにおいては既にノックイン動物の作製に成功しているが効率が低いため、相同組み換えに作用する因子である、一本鎖DNA結合タンパク質のRad51, Dmc1、ヘリカーゼ・ヌクレアーゼのMRXタンパク質複合体（Mre11/Rad50/Xrs2）のmRNAを同時に注入して過剰発現させるなどの方法も検討する。またCre/loxP系を介さずにCRISPR/Cas系を条件的に発現させたコンディショナルKO動物は、線虫では報告されたが哺乳類では未だ報告が無いため、これの作成も検討していく予定である。
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