マイクロサテライト不安定性を呈する発癌機構の統合的理解と新たな治療体系の確立

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 25253080
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 渡邉 聡明 東京大学, 医学部附属病院, 教授 (80210920)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 佐藤 俊朗 慶應義塾大学, 医学部, 准教授 (70365245)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 大腸癌 / 発癌 / 幹細胞 / オルガノイド / 遺伝子導入 / マイクロサテライト不安定性 / メチル化

Outline of Annual Research Achievements

１．遺伝子相同組換えを利用した大腸上皮オルガノイドへの効率的かつ特異的な遺伝子編集技術の確立
BRAF遺伝子変異をはじめとした，がん関連遺伝子変異を大腸上皮オルガノイドに対して導入するため，最新の遺伝子編集技術であるCRISPR/Cas9システムを利用した遺伝子編集技術を確立した．これまでに報告されていたのはトランスフェクション試薬を用いた低効率な手法のみであったが，我々はオルガノイド培養方法の改良，ならびに遺伝子導入にエレクトロポレーション法を用いることで，飛躍的に遺伝子導入および編集効率の向上を達成した．本方法を用いたヒト大腸上皮細胞に対する遺伝子変異ノックインにより，BRAF遺伝子変異大腸上皮オルガノイドを作製することに成功した．
２．大腸鋸歯状病変オルガノイドならびにBRAF遺伝子変異オルガノイドに関する分子生物学的解析
BRAF遺伝子変異は大腸serrated pathwayの初期から認められ，CpGアイランドのメチル化(CIMP)はその後の段階で獲得するとされていることから，BRAF遺伝子変異オルガノイドがin vitroでCIMPを自然獲得するか検討した．長期培養や低酸素下を含む様々な条件での検討を行ったが，in vitroでのCIMP獲得は確認されなかった．一方で，前年度に樹立したCIMPを有する大腸鋸歯状腺腫オルガノイドに対してCRISPR/Cas9システムを利用し，大腸癌において高頻度で認められる代表的な遺伝子変異を導入した．この変異導入鋸歯状腺腫オルガノイドは異種移植下にて肝転移を含めた高度な悪性形質を示し，CIMP自体が悪性形質獲得に大きく寄与していることが示唆された．

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初は，大腸上皮オルガノイドに対するゲノム編集ツールとしてTALEN(Transcription Activator-Like Effector DNA Nuclease)の利用を計画していたが，その後に開発されたCRISPR/Cas9システムを用いることで，簡便かつ効率的なゲノム編集を行うことが可能となった．加えて，培養方法ならびに遺伝子導入法の工夫により，最大の障壁と考えられた正常大腸上皮オルガノイドに対する任意の遺伝子に対するゲノム編集方法を確立できた．この手法により正常大腸上皮オルガノイドに対するBRAF遺伝子変異ノックインを行い，大腸serrated pathwayの初期像をin vitroで再現することに成功した．BRAF遺伝子変異オルガノイドに対するCpGアイランドメチル化を誘導すべく様々な培養条件検討を行ったが，現在のところ異常メチル化は確認できておらず，当初予定していた異常メチル化の解明には至っていない．
一方，CIMPに対する別アプローチとして，良性病変である鋸歯状腺腫から樹立したオルガノイド株に対して大腸癌で高頻度で認められる遺伝子変異を導入したところ，異種移植下にて悪性形質を示した．このことから，CIMP自体が悪性形質獲得に大きく寄与する可能性があるという新たな知見を得ることができた．

Strategy for Future Research Activity

１．大腸serrated pathwayにおける異常メチル化機構の解明
引き続き，serrated pathwayにおいて大腸上皮が異常メチル下を獲得する分子生物学的メカニズムの解明を目指す．in vitroの培養のみではメチル下を誘導できない可能性を考え，BRAF変異オルガノイドのマウス大腸上皮への移植，あるいは線維芽細胞との共培養等の条件を検討する予定としている．
２．異常メチル化をターゲットとしたMSI大腸癌治療法の確立
前年度に成功した鋸歯状腺腫に対する遺伝子変異導入による癌化を，別患者由来の過形成ポリープや鋸歯状腺腫を利用し再現性を確認する．別ラインでも同様の形質を獲得することを示し，MSI大腸癌の悪性形質におけるCIMPの寄与を実証する．これら人工CIMP大腸癌オルガノイドに対し，薬剤投与などによる脱メチル化による腫瘍増殖抑制効果を検討し，異常メチル化がMSI大腸癌の治療ターゲットとなりうることを示す．

Research Products

• [Journal Article] Modeling colorectal cancer using CRISPR-Cas9-mediated engineering of human intestinal organoids. (2015)
  • Author(s): Matano M, Date S, Shimokawa M, Takano A, Fujii M, Ohta Y, Watanabe T, Kanai T, Sato T.
  • Journal Title: Nature Medicine Volume: 21 Pages: 256-62
  • DOI: 10.1038/nm.3802
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Prediction of the preoperative chemoradiotherapy response for rectal cancer by peripheral blood lymphocyte subsets. (2015)
  • Author(s): Tada N, Kawai K, Tsuno NH, Ishihara S, Yamaguchi H, Sunami E, Kitayama J, Oba K, Watanabe T.
  • Journal Title: World J Surg Oncol Volume: 13 Pages: 30
  • DOI: 10.1186/s12957-014-0418-0
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Phosphatidylserine-specific phospholipase A1 (PS-PLA1) expression in colorectal cancer correlates with tumor invasion and hematogenous metastasis. (2015)
  • Author(s): Iida Y, Sunami E, Yamashita H, Hiyoshi M, Ishihara S, Yamaguchi H, Inoue A, Makide K, Tsuno NH, Aoki J, Kitayama J, Watanabe T.
  • Journal Title: Anticancer Res. Volume: 35 Pages: 1459-64
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Log odds of positive lymph nodes as a prognostic indicator in stage IV colorectal cancer patients undergoing curative resection. (2015)
  • Author(s): Ozawa T, Ishihara S, Sunami E, Kitayama J, Watanabe T.
  • Journal Title: J Surg Oncol Volume: 111 Pages: 465-71
  • DOI: 10.1002/jso.23855
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A phase I dose escalation study of oxaliplatin plus oral S-1 and pelvic radiation in patients with locally advanced rectal cancer (SHOGUN trial). (2015)
  • Author(s): Ishihara S, Matsusaka S, Kondo K, Horie H, Uehara K, Oguchi M, Murofushi K, Ueno M, Mizunuma N, Shinbo T, Kato D, Okuda J, Hashiguchi Y, Nakazawa M, Sunami E, Kawai K, Yamashita H, Okada T, Ishikawa Y, Nakajima T, Watanabe T.
  • Journal Title: Radiat Oncol Volume: 10 Pages: 24
  • DOI: 10.1186/s13014-015-0333-8
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Prognostic significance of the lymph node ratio in stage IV colorectal cancer patients who have undergone curative resection. (2015)
  • Author(s): Ozawa T, Ishihara S, Nishikawa T, Tanaka T, Tanaka J, Kiyomatsu T, Hata K, Kawai K, Nozawa H, Kanazawa T, Kazama S, Yamaguchi H, Sunami E, Kitayama J, Watanabe T.
  • Journal Title: Ann Surg Oncol Volume: 22 Pages: 1513-9
  • DOI: 10.1245/s10434-014-4184-6
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Nomogram prediction of metachronous colorectal neoplasms in patients with colorectal cancer. (2015)
  • Author(s): Kawai K, Ishihara S, Yamaguchi H, Sunami E, Kitayama J, Miyata H, Watanabe T.
  • Journal Title: Ann Surg Volume: 261 Pages: 926-32
  • DOI: 10.1097/SLA.0000000000000881
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Incidence and prognostic significance of positive peritoneal lavage in colorectal cancer. (2015)
  • Author(s): Nishikawa T, Sunami E, Tanaka T, Tanaka J, Kiyomatsu T, Kawai K, Hata K, Kazama S, Nozawa H, Ishihara S, Watanabe T.
  • Journal Title: Surg Today Volume: Epub ahead of print Pages: Epub
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Characteristics and prognosis of colorectal cancer associated with rheumatic disease. (2015)
  • Author(s): Kishikawa J, Kawai K, Tsuno N, Yamaguchi H, Ishihara S, Sunami E, Watanabe T.
  • Journal Title: Int Surg Volume: Epub ahead of print Pages: Epub
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Detection of carcinoembryonic antigen mRNA in peritoneal lavage by the transcription-reverse transcription concerted method indicates poor prognosis in patients with stage II and III colon cancer. (2014)
  • Author(s): Murono K, Kazama S, Yamaguchi H, Kawai K, Ishihara S, Sunami E, Kitayama J, Satoh Y, Kurihara M, Yatomi Y, Watanabe T.
  • Journal Title: Surgery Volume: 157 Pages: 322-30
  • DOI: 10.1016/j.surg.2014.09.015
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Prognostic impact of primary tumor resection and lymph node dissection in stage IV colorectal cancer with unresectable metastasis: a propensity score analysis in a multicenter retrospective study. (2014)
  • Author(s): Ishihara S, Hayama T, Yamada H, Nozawa K, Matsuda K, Miyata H, Yoneyama S, Tanaka T, Tanaka J, Kiyomatsu T, Kawai K, Nozawa H, Kanazawa T, Kazama S, Yamaguchi H, Sunami E, Kitayama J, Hashiguchi Y, Sugihara K, Watanabe T.
  • Journal Title: Ann Surg Oncol Volume: 21 Pages: 2949-55
  • DOI: 10.1245/s10434-014-3719-1
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Nuclear Notch3 expression is associated with tumor recurrence in patients with stage II and III colorectal cancer. (2014)
  • Author(s): Ozawa T, Kazama S, Akiyoshi T, Murono K, Yoneyama S, Tanaka T, Tanaka J, Kiyomatsu T, Kawai K, Nozawa H, Kanazawa T, Yamaguchi H, Ishihara S, Sunami E, Kitayama J, Morikawa T, Fukayama M, Watanabe T.
  • Journal Title: Ann Surg Oncol Volume: 21 Pages: 2650-8
  • DOI: 10.1245/s10434-014-3659-9
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Prediction of response to preoperative chemoradiotherapy in rectal cancer by using reverse transcriptase polymerase chain reaction analysis of four genes. (2014)
  • Author(s): Watanabe T, Kobunai T, Akiyoshi T, Matsuda K, Ishihara S, Nozawa K.
  • Journal Title: Dis Colon Rectum Volume: 57 Pages: 23-31
  • DOI: 10.1097/01.dcr.0000437688.33795.9d
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Changes in the plasma levels of cytokines/chemokines for predicting the response to chemoradiation therapy in rectal cancer patients. (2014)
  • Author(s): Tada N, Tsuno NH, Kawai K, Murono K, Nirei T, Ishihara S, Sunami E, Kitayama J, Watanabe T.
  • Journal Title: Oncol Rep Volume: 31 Pages: 463-71
  • DOI: 10.3892/or.2013.2857
  • Peer Reviewed