2014 Fiscal Year Annual Research Report
小児外科領域の難治性疾患における脱落乳歯幹細胞を用いた新規治療法の開発
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25253094
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
田口 智章 九州大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (20197247)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
野中 和明 九州大学, 歯学研究科(研究院), 教授 (90128067)
大賀 正一 山口大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (60233053)
中山 功一 佐賀大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (50420609)
小田 義直 九州大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (70291515)
井原 健二 大分大学, 医学部, 教授 (80294932)
山座 孝義 九州大学, 歯学研究科(研究院), 講師 (80304814)
山座 治義 九州大学, 歯学研究科(研究院), 講師 (30336151)
柳 佑典 九州大学, 医学(系)研究科(研究院), 研究員 (30596664)
家入 里志 九州大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (00363359)
林田 真 九州大学, 大学病院, 助教 (70452761)
永田 公二 九州大学, 大学病院, 助教 (20419568)
吉丸 耕一朗 九州大学, 大学病院, その他 (60711190)
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| Project Period (FY) |
2013-10-21 – 2016-03-31
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| Keywords | 再生医学 / 幹細胞移植 / 乳歯幹細胞 / 代謝性肝疾患 / 先天性横隔膜ヘルニア / 肺低形成 / 肝組織工学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
肝臓
１）乳歯幹細胞および乳歯幹細胞由来肝細胞の安全性試験①乳歯幹細胞または乳歯幹細胞由来肝細胞を免疫不全マウスの皮下ならびに精巣へ移植し、移植後８週まで移植部位を観察した所、非移植部位と比較して異常増殖は認められなかった。また、飼育期間中のマウスの体重減少等の全身的異常も認められなかった。②四塩化炭素誘導性肝障害モデルに、乳歯幹細胞ならびに乳歯幹細胞由来肝細胞を経脾的に移植後４週にて採取した肝組織より病理組織学的標本を作製した。H&E染色による、レシピエント肝組織に腫瘍増殖を思わせる所見は認められなかった。また抗HLA-ABC抗体ならびに抗HepPar1抗体を用いた免疫組織学的解析により、ドナー細胞の生着が認められた。しかし、ドナー細胞による腫瘍組織像は観察されなかった。③乳歯幹細胞と乳歯幹細胞由来肝細胞を比較したCGH解析では、明らかなゲノムDNAの過剰、欠失、増幅などのコピー数異常は検出されなかった。
2)乳歯幹細胞由来肝細胞を用いた機能的肝立体構造体の製造系の条件確立:ヒト乳歯幹細胞由来肝細胞より段階的に細胞数を変えてスフェロイドを作成。スフェロイド形成期間、サイズ、低酸素マーカー染色、TUNNEL染色による細胞生存率を解析し、最適なスフェロイド作成条件を決定した。
3) 立体構造体の移植適正部位の検討: 異所性移植では胆汁排泄ができないため肝臓内移植とし、①肝臓内に埋植②肝切離断端に移植の２方法を比較検討した。まず、ラット肝臓より切り出した組織片での移植では、前者で組織の圧迫所見がみられ後者のほうが生着がよかった。
横隔膜
ヒト横紋筋芽細胞、臍帯静脈内皮細胞、骨髄由来幹細胞を用いて血管内皮ネットワークを有する1x1cmの横紋筋シートを作製することに成功した。また、ニトロフェン誘導先天性横隔膜モデル胎仔ラットに対する成獣肺間葉系幹細胞投与の肺成熟効果に関し、論文投稿した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
計画通り乳歯幹細胞の肝細胞への分化誘導法を確立および、免疫寛容性が高いことをin vitroで確認した。さらには、小動物に対して非免疫抑制下に異種移植実験を行い拒絶されないことを確認し、疾患モデル動物に対するSHED由来肝細胞の生着および生命予後および肝機能の改善を確認した。また、本年度は造腫瘍性がないことなど安全性の確認を行い、これらの結果からSHED由来肝細胞の安全性、有効性が確認され、臨床応用において有用な細胞ソースであることが実証された。立体組織化も昨年度のラットに引き続きヒト成熟肝細胞を用いて成功し、本年度はSHED由来肝細胞をを用いた立体肝組織の作製条件を検討し、立体組織作製が可能となった。横隔膜ヘルニアに対する研究においては、幹細胞移植が肺低形成に対する治療効果が有することを確認したが、今後はSHEDでの有効性の評価が必要と考える。また、培養ヒト骨格筋芽細胞を用いて細胞シートの作成に成功したが、移植に耐えうる強度には達しておらず今後も検討が必要である。
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| Strategy for Future Research Activity |
肝臓においては、SHED由来肝細胞の細胞移植による有効性が確認できたため、今後はSHED由来肝細胞を用いた立体肝組織移植の有効性実証を進めていく予定である。
具体的には、1）ヒト乳歯幹細胞由来肝細胞を用いた立体肝組織の最適化：ヒト歯髄幹細胞由来肝細胞よりバイオ3Dプリンターを用いて、立体肝組織を作製する。立体肝組織の細胞の生存率及びアンモニア代謝やアルブミン産生などを指標に最適化を行う。2）立体肝組織移植の有効性評価： ヒト乳歯幹細胞を用いた立体肝組織を四塩化炭素誘導性肝障害モデルマウスやOTC欠損マウスに対し肝臓内に移植し、治療効果を検証する。
横隔膜においては、引き続き移植可能な横紋筋シートの作製を進めていく。肺低形成に対する治療では組織幹細胞の有効性が確認されたため、今後はSHEDの有効性の検証を進めていく。
具体的には、1) ヒト培養横紋筋芽細胞を用いた横紋筋シートの作製：ヒト培養横紋筋芽細胞から細胞凝集体（スフェロイド）を作製し、ロボットシステムを用いて横紋筋シートを作製する。作製したシートの強度解析を行う。特に、HUVECやMSCとの共培養や、還流培養、伸展培養などを用いて強度の向上を図る。2)外科的CDHモデルラットにおける横隔膜シートを用いた横隔膜修復試験：ヌードラットにおいて左横隔膜に横隔膜欠損孔を作製する。ヒト培養横紋筋細胞横隔膜シートを用いて欠損孔を修復する。ラットの生存率およびシートの形態的、病理学的評価を行う。3) ニトロフェン誘導CDHモデルラットの低形成肺に対するSHED投与の有効性、安全性確認：肺低形成を伴うCDHモデルラットにSHEDを経静脈投与。肺成熟効果の解析を行う。
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[Journal Article] Isolated intestinal neuronal dysplasia Type B (IND-B) in Japan: results from a nationwide survey.2014
Author(s)
Taguchi T, Kobayashi H, Kanamori Y, Segawa O, Yamataka A, Sugiyama M, Iwanaka T, Shimojima N, Kuroda T, Nakazawa A, Oda Y, Miyoshi K,Ieiri S.
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Journal Title
Pediatr Surg Int
Volume: 30(8)
Pages: 815-822
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Pediatric chronic intestinal pseudo-obstruction is a rare, serious, and intractable disease: A report of a nationwide survey in Japan.2014
Author(s)
Muto M, Matsufuji H, Tomomasa T, Nakajima A, Kawahara H, Ida S, Ushijima K, Kubota A, Mushiake S, Taguchi T.
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Journal Title
J Pediatr Surg
Volume: 49(12)
Pages: 1799-1803
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Presentation] Current status and prognosis of allied disorders of Hirschsprung's disease in Japan-A report from Japanese Study Group of allied disorders of Hirschsprung's disease-2014
Author(s)
Taguchi T,Ieiri S,Miyoshi K,Watanabe Y,Kobayashi H,Fukuzuwa M,Hamada Y,Yagi M,Matsufuji H,Nakazawa A,Kubota A,Iwanaka T,Matsui A
Organizer
PAPS2014
Place of Presentation
Banff,Alberta
Year and Date
2014-05-25 – 2014-05-29
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