歯周炎・糖尿病・リウマチの共通リスクサイトカイン遺伝子の解明

2013 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 25253104
• Research Institution: Niigata University
• Principal Investigator: 吉江 弘正 新潟大学, 医歯学系, 教授 (20143787)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 高柴 正悟 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (50226768) ; 永田 俊彦 徳島大学, ヘルスバイオサイエンス研究部, 教授 (10127847) ; 野口 俊英 愛知学院大学, 歯学部, 教授 (50014262) [Withdrawn] ; 小林 哲夫 新潟大学, 医歯学総合病院, 准教授 (00215344) ; 前田 博史 大阪歯科大学, 歯学部, 教授 (00274001) [Withdrawn] ; 木戸 淳一 徳島大学, ヘルスバイオサイエンス研究部, 准教授 (10195315) ; 石原 裕一 松本歯科大学, 歯学部, 教授 (50261011) ; 三谷 章雄 愛知学院大学, 歯学部, 教授 (50329611) ; 大森 一弘 岡山大学, 大学病院, 講師 (20549860)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: サイトカイン遺伝子 / 歯周炎 / 糖尿病 / 関節リウマチ

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は、歯周炎、糖尿病（DM）、関節リウマチ（RA）に共通するリスクサイトカイン遺伝子を特定して、in vitro・マウスモデル機能解析により共通発症機序を解明することである。
本年度は、参加研究施設全体での倫理委員会承認の遅延のため対象者数の確保が計画目標を下回り、歯周炎７名、DM８名、RA200名、健常38名であった。リスクサイトカイン遺伝子の臨床的評価として、17遺伝子多型（IL-1A+4845, IL-1B -31/+3954, TNF-a61537; -863/-857, IL-6-572, STAT 3の５多型、PTPN22の２多型、PADI4の３多型、KCNQ1多型）については、健常者由来DNAを対象にTaqMan Genotypingを用いたタイピングの条件設定がほぼ完了し、本実験に向けた準備が整いつつある。腫瘍壊死因子(TNF)-alpha遺伝子のメチル化状態をRA 30名、健常群30名を対象に解析した結果、同遺伝子プロモーター領域の10 CpG部位においてメチル化を検出した。メチル化頻度は６CpG部位（-163 bp, -161 bp, -119 bp, -72 bp, -49 bp, -38 bp）において統計学的な有意差が認められた。これらの部位は転写因子結合領域に近接しており、メチル化の有無によってTNF-alpha遺伝子の発現活性に影響を及ぼす可能性が考えられる。リスクサイトカイン遺伝子の基礎的評価として、インターロイキン－１レセプターアンタゴ二スト（IL-1Ra）遺伝子欠損マウスの歯周炎疾患感受性を解析した結果、野生型マウスと比べ破骨細胞分化関連遺伝子の発現が増加しており、骨形成関連遺伝子の発現は抑制が認められた。したがって、IL-1Ra遺伝子は歯周炎の病態形成に関与することが示唆された。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

各大学の倫理委員会、遺伝子倫理委員会、利益相反委員会等の承認が、多くの指摘事項により、研究計画の見直しや修正が必要となった。その結果、臨床サンプルの採取や遺伝子解析等が期間内にできず、全体の計画がやや遅延することとなった。

Strategy for Future Research Activity

１）対象者の臨床検査、診断、臨床検体採取（担当：分担者全員）:各大学病院にて、歯周炎のみ罹患した患者200名、糖尿病・関節リウマチと診断され歯周炎にも罹患した患者各200名、内科疾患の無い年齢・性別比がマッチした歯周状態健常者200名を対象に、歯周検査および末梢血液採取を行う。３疾患との関連性が示唆されている炎症性サイトカインと関連レセプター多型のインベーダーオリゴ・シグナルプローブを用いてインベーダー法にて遺伝子型を決定する。
２）ゲノムDNAをバイサルファイト処理後、IL-6・TNFプロモーター領域のプライマーを用いてバイサルファイト・シークエンス法にてメチル化判定およびメチル化強度を算定する（担当：新潟大学）。
３）ヒト歯肉線維芽細胞におけるIL-6発現をsiRNAを用いてノックダウンし、炎症に関連した因子や酸化ストレスマーカーなどの検討によりIL-6のリスクサイトカインの可能性を検討する（担当：徳島大学）。
４）Porphyromonas gingivalisのpeptidylarginine deiminases遺伝子ならびにenolase遺伝子に特異的なプライマーを設計し、PCR法によって増幅し，増幅産物をクローニングベクターに組み込み、クローニングベクターによって形質転換された大腸菌のタンパク質プロファイルを調べる（担当：岡山大学）。
５）関節炎を自然発症するIL-1RaKOマウスの膝関節を歯周炎群とコントロール群で組織学的ならびに膝関節の関節液あるいは関節のホモジナイズサンプル中の炎症性メディエーター量を比較検討する（担当：愛知学院大学）。

Research Products

• [Journal Article] Assessment of Interleukin-6 Receptor Inhibition Therapy on Periodontal Condition in Patients with Rheumatoid Arthritis and Chronic Periodontitis. (2014)
  • Author(s): Kobayashi T, Okada M, Ito S, Kobayashi D, Ishida K, Kojima A, Narita I, Murasawa A, Yoshie H.
  • Journal Title: J Periodontol Volume: 85 Pages: 57-67
  • DOI: 10.1902/jop.2013.120696
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Amino acid profiles in relation to chronic periodontitis and rheumatoid arthritis. (2014)
  • Author(s): Kobayashi T, Okada M, Ito S, Kobayashi D, Shinhara A, Muramatsu T, Kobayashi T, Narita I, Nakazono K, Murasawa A, Yoshie H.
  • Journal Title: Open Journal of Stomatology Volume: 4 Pages: 49-55
  • DOI: http://dx.doi.org/10.4236/ojst.2014.42009
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Inflammatory bone loss in experimental periodontitis induced by Aggregatibacter actinomycetemcomitans in IL-1Ra knockout mice. (2014)
  • Author(s): Izawa A, Ishihara Y, Mizutani H, Kobayashi S, Goto H, Okabe E, Takeda H, Ozawa Y, Kamiya Y, Sugita Y, Kubo K, Kamei H, Kikuchi T, Mitani A, Hayashi J, Nishihara T, Maeda H, Noguchi T.
  • Journal Title: Infect. Immun. Volume: 82 Pages: 1904-1913
  • DOI: 10.1128/IAI.01618-13
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Lipopolysaccharide of Aggregati- bacter actinomycetemcomitans upregulates inflammatory cytokines, PGE2 synthesis, and osteoclast formation in IL-1Ra deficient mice. (2013)
  • Author(s): H. Mizutani, Y. Ishihara, A. Izawa, Y. Fujihara, S. Kobayashi, H. Gotou, E. Okabe, H. Takeda, Y. Ozawa, Y. Kamiya, H. Kamei, T. Kikuchi, G. Yamamoto, A. Mitani, T. Nishihara, T. Noguchi
  • Journal Title: J Periodont Res Volume: 48 Pages: 748-756
  • DOI: 10.1111/jre.12065
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] Advanced glycation end-product increases oxidative stress in human gingival fibroblasts. (2013)
  • Author(s): Kajiura Y, Bando M, Inagaki Y, Murata H, Kido J, Nagata T.
  • Organizer: Korean Academy of Periodontology Meeting
  • Place of Presentation: ソウル市（大韓民国）
  • Year and Date: 2013-11-22 – 2013-11-23
• [Presentation] 歯周炎罹患組織におけるIL-6遺伝子プロモーター領域のメチル化解析 (2013)
  • Author(s): 石田光平、小林哲夫、横山智子、岡田 萌、小島杏里、小松康高、吉江弘正
  • Organizer: 日本歯科保存学会2013年度秋季学術大会（第139回）
  • Place of Presentation: 秋田県総合生活文化会館（秋田市）
  • Year and Date: 2013-10-18
• [Presentation] 慢性歯周炎患者におけるTNF-a遺伝子プロモーター領域のメチル化解析 (2013)
  • Author(s): 小島杏里、小林哲夫、石田光平、岡田 萌、吉江弘正
  • Organizer: 第５６回秋季日本歯周病学会学術大会
  • Place of Presentation: 前橋市市民文化会館（前橋市）
  • Year and Date: 2013-09-22
• [Presentation] IL-1Receptor antagonist のRNA干渉がヒト歯肉上皮細胞の接着分子発現へ及ぼす影響 (2013)
  • Author(s): 後藤久嗣，石原裕一，伊澤有郎，岡部栄治郎，久保勝俊，杉田好彦，前田初彦，野口俊英
  • Organizer: 第56回秋季日本歯周病学会
  • Place of Presentation: 前橋市市民文化会館（前橋市）
  • Year and Date: 2013-09-22
• [Presentation] 関節リウマチ患者における歯周状態のTNF標的療法反応性に及ぼす影響 (2013)
  • Author(s): 横山智子、小林哲夫、岡田 萌、吉江弘正
  • Organizer: 第５６回秋季日本歯周病学会学術大会
  • Place of Presentation: 前橋市市民文化会館（前橋市）
  • Year and Date: 2013-09-22
• [Presentation] Effect of Interkeukin-6 Receptor Inhibition Therapy on Periodontal Condition in Patients with Rheumatoid Arthritis and Periodontitis. (2013)
  • Author(s): Kobayashi T, Okada M, Ito S, Kobayashi D, Ishida K, Kojima A, Narita I, Murasawa A, Yoshie H.
  • Organizer: The 10th. Asian Pacific Society of Periodontology Meeting
  • Place of Presentation: 奈良県新公会堂（奈良市）
  • Year and Date: 2013-09-03 – 2013-09-04
• [Presentation] Interkeukin-6 Gene Promoter Methylation in Periodontal Tissues. (2013)
  • Author(s): Ishida K, Kobayashi T, Yokoyama T, Okada M, Kojima A, Yoshie H.: Interkeukin-6
  • Organizer: The 10th. Asian Pacific Society of Periodontology Meeting
  • Place of Presentation: 奈良県新公会堂（奈良市）
  • Year and Date: 2013-09-03 – 2013-09-04
• [Presentation] Effects of Periodontal Treatment on Antibodies to Porphyromonas gingivalis and Citrulline levels and Rheumatoid Arthritis Condition (2013)
  • Author(s): Okada M, Kobayashi T, Ito S, Yokoyama T, Abe A, Murasawa A, Yoshie H
  • Organizer: The 10th. Asian Pacific Society of Periodontology Meeting
  • Place of Presentation: 奈良県新公会堂（奈良市）
  • Year and Date: 2013-09-03 – 2013-09-04
• [Presentation] Tumor Necrosis Factor-Alpha Gene Promoter Methylation in Chronic Periodontitis. (2013)
  • Author(s): Kojima A, Kobayashi T, Ishida K, Okada M, Yoshie H.:
  • Organizer: The 10th. Asian Pacific Society of Periodontology Meeting
  • Place of Presentation: 奈良県新公会堂（奈良市）
  • Year and Date: 2013-09-03 – 2013-09-04
• [Presentation] 関節リウマチ患者におけるトシリズマブ治療の歯周状態への影響. (2013)
  • Author(s): 小林哲夫、岡田 萌、石田光平、小島杏里、吉江弘正
  • Organizer: 日本歯科保存学会2013年度春季学術大会（第138回）
  • Place of Presentation: 福岡国際会議場（福岡市）
  • Year and Date: 2013-06-28
• [Presentation] 最終糖化産物が歯肉線維芽細胞における酸化ストレス反応に及ぼす影響 (2013)
  • Author(s): 梶浦由加里，板東美香，稲垣裕司，木戸淳一，永田俊彦
  • Organizer: 第56回春季日本歯周病学会学術大会
  • Place of Presentation: タワーホール船堀（東京都）
  • Year and Date: 2013-06-01
• [Presentation] IL-6受容体抑制治療中の関節リウマチ患者の歯周状態 (2013)
  • Author(s): 小林哲夫、岡田 萌、石田光平、小島杏里、吉江弘正
  • Organizer: 第５６回春季日本歯周病学会学術大会
  • Place of Presentation: タワーホール船堀（東京都）
  • Year and Date: 2013-05-31
• [Presentation] トシリズマブ（TCZ）療法中の関節リウマチ患者の歯周状態 (2013)
  • Author(s): 小林哲夫、伊藤 聡、小林大介、成田一衛、村澤 章、吉江弘正：
  • Organizer: 第５７回日本リウマチ学会総会・学術集会
  • Place of Presentation: 京都国際会館（京都市）
  • Year and Date: 2013-04-19