2014 Fiscal Year Annual Research Report
エピジェネティック毒性の通常毒性試験での検出を可能とするレポーターマウスの開発
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25281028
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| Research Institution | Hoshi University |
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Principal Investigator |
五十嵐 勝秀 星薬科大学, 付置研究所, 准教授 (30342885)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大塚 まき 星薬科大学, 付置研究所, 助教 (40734372)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | ゲノム / エピジェネティクス / 毒性試験 / レポーター / 有害化学物質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
化学物質影響がゲノムに記憶されるエピジェネティック毒性の重要性が指摘されているが、そのリスクへの対応はほとんど進んでいない。その原因として、エピジェネティック毒性検出手法が高度な生化学解析技術を要するために毒性試験となじまず、毒性試験データからエピジェネティック毒性を検出することが容易ではないことがあげられる。本研究では、遺伝子組み換え技術を駆使し、観察が容易なマーカーによってエピジェネティック毒性の有無を検出するレポーターマウスを開発する。それにより、通常の毒性試験時に高度な技術を必要とせずにエピジェネティック毒性の有無を判定できる「個体レベル評価システムの構築」を目指す。本研究は、１）レポーターマウス作製に必要なベクターの構築、２）培養細胞を用いた最適化、３）その結果を反映させたレポーターマウス作製、４）既知のDNA脱メチル化物質アザシチジンを用いたマウスの有用性検証、の４つのステップに分けて実施する。
本年度は、レポーターマウス作製に必要なベクターの構築に注力した。
化学物質によるDNAメチル化影響をマウス組織において可視化するために提案しているシステムの原理は、
DNAメチル化を受ける特定の標的配列を決定し、それを発現制御DNA領域としてGFPなどの蛍光マーカータンパク質の上流に挿入し、標的配列を能動的にDNAメチル化することで蛍光マーカータンパク質の発現を抑制することである。化学物質の影響により、標的配列のDNAメチル化が解除されると蛍光マーカータンパク質が発現し、影響が検出される。当初、標的配列としてCpG配列を複数有する完全人工配列を考えて研究を進めていたが、毒性試験への応用を考えた場合、出来るだけ全身の細胞において発現する配列を選ぶ必要があるとの認識を強くした。
そのため、標的配列の選択をし直す方が賢明であるとの判断をせざるを得ず、ベクター作製も修正が必要となった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究は、化学物質によるDNAメチル化影響を組織において可視化可能なレポーターマウスを作製することである。そのシステムでは、DNAメチル化を受ける特定の標的配列を決定し、それを発現制御DNA領域としてGFPなどの蛍光マーカータンパク質の上流に挿入し、標的配列を能動的にDNAメチル化することで蛍光マーカータンパク質の発現を抑制する。
当初、標的配列としてCpG配列を複数有する完全人工配列を考えて研究を進めていたが、毒性試験への応用を考えた場合、出来るだけ全身の細胞において発現する配列を選ぶ必要があるとの認識を強くし、標的配列の選択をし直す方が賢明であるとの判断をせざるを得ず、ベクター作製も修正が必要となったため、研究の進捗が遅れていると判断せざるを得ない。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究では、毒性試験において汎用性高く用いられるエピジェネティック毒性レポーターマウス作製を目指している。当初、レポーターシステムの標的配列として、CpG配列を複数有する完全人工配列を念頭に研究を進めていたが、毒性試験への応用を考えた場合、出来るだけ全身の細胞において発現する配列を選ぶ必要があるとの認識を強くし、標的配列の再選択を決断した。これにより、出来上がってくるレポーターマウスの意義が増すものと考えている。標的配列としては、全身の細胞において発現することが明らかないわゆるハウスキーピング遺伝子を想定しており、プロモーター領域におけるCpG配列を含む配列の比較を通して選択することが可能であると考えている。よって、今後はベクター作製も含め、研究のスピードが増すと考えられる。
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| Causes of Carryover |
ベクター構築にあたり、全身の細胞で反応することが見込まれる標的配列への変更が生じ、それらのベクター作製および培養細胞での検討を次年度に実施することとした。そのため、次年度使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
ベクター構築を徹底して進める。そのための試薬購入に用いると同時に、培養細胞での最適化に要する試薬購入に用いる。
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Research Products
(9 results)
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[Journal Article] Identification of myelin transcription factor 1 (MyT1) as a subunit of the neural cell type-specific lysine-specific demethylase 1 (LSD1) complex.2014
Author(s)
Yokoyama A, Igarashi K, Sato T, Takagi K, Otsuka I M, Shishido Y, Baba T, Ito R, Kanno J, Ohkawa Y, Morohashi K, Sugawara A.
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Journal Title
J Biol Chem.
Volume: 289
Pages: 18152-18162
DOI
Peer Reviewed
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