無細胞蛋白質アレイによる炎症カスパーゼ基質シグナル伝達分子の網羅的同定と解析

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 25290077
• Research Institution: Ehime University
• Principal Investigator: 澤崎 達也 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 教授 (50314969)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: カスパーゼ１ / 炎症 / 無細胞 / 蛋白質 / 基質 / プロテアーゼ / カスパーゼ

Outline of Annual Research Achievements

平成25・26年度で見出した新規カスパーゼ基質が細胞内でカスパーゼ１依存的に切断されるか、また切断産物が細胞内で安定に存在するかどうかの評価を研究目標とした。
HEK293TおよびJurkat細胞を用いた新規基質分子の細胞レベル解析：遺伝子導入効率が高いHEK293T細胞およびがん化T細胞であるJurkat細胞を用いて、活性化型もしくは不活性変異体カスパーゼ１と新規基質と共発現させて切断を確認した。その結果、活性化型カスパーゼ１との共発現でのみ、切断が確認できた。また、その切断はカスパーゼ１（Z-WEHD-FMK）もしくは一般的なカスパーゼ（Pan Caspase Inhibitor Z-VAD-FMK）の阻害剤処理においても、切断は抑制された。さらに、新規基質の切断部位変異体は切断されなかった。興味深いことに、C末端断片が細胞内で安定に存在した。
カスパーゼ１が恒常的に活性化しているT細胞を用いた新規基質分子の細胞レベル解析：新規基質分子がT細胞で発現していることがデータベース解析で分かった。そこで、カスパーゼ１が恒常的に活性化しているT細胞を用いて、内在の新規基質遺伝子の切断を調べたところ、切断が確認され新規基質分子のC末端断片のみ検出できた。また、その切断はカスパーゼ１（Z-WEHD-FMK）もしくは一般的なカスパーゼ（Pan Caspase Inhibitor Z-VAD-FMK）の阻害剤処理においても、切断は抑制された。
以上の結果より、本研究よりカスパーゼ１の新規基質分子を新たに同定することに成功した。

Research Progress Status

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Causes of Carryover

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Expenditure Plan for Carryover Budget

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Production of monoclonal antibodies against GPCR using cell-free synthesized GPCR antigen and biotinylated liposome-based interaction assay. (2015)
  • Author(s): Takeda H, Ogasawara T, Ozawa T, Muraguchi A, Jih PJ, Morishita R, Uchigashima M, Watanabe M, Fujimoto T, Iwasaki T, Endo Y, Sawasaki T.
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 5 Pages: 11333
  • DOI: 10.1038/srep11333
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Members of the Plant CRK-superfamily are Capable of trans-/auto-Phosphorylation of Tyrosine Residues. (2015)
  • Author(s): Nemoto K, Takemori N, Seki M, Shinozaki K, Sawasaki T.
  • Journal Title: The Journal of Biological Chemistry Volume: 290 Pages: 16665-16677
  • DOI: 10.1074/jbc.M114.617274
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Wheat germ-based protein libraries for the functional characterisation of the Arabidopsis E2 ubiquitin conjugating enzymes and the RING-type E3 ubiquitin ligase enzymes. (2015)
  • Author(s): Ramadan A, Nemoto K, Seki M, Shinozaki K, Takeda H, Takahashi H, Sawasaki T.
  • Journal Title: BMC Plant Biology Volume: 15 Pages: 275
  • DOI: 10.1186/s12870-015-0660-9
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Na, K-ATPase α3 is a death target of Alzheimer patient amyloid-β assembly. (2015)
  • Author(s): Ohnishi T, Yanazawa M, ..., Sawasaki T, Iwasaki G, Nakamura Y, Nabeshima YI, Teplow DB, Hoshi M.
  • Journal Title: Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America Volume: 112 Pages: E4465-4474
  • DOI: 10.1073/pnas.1421182112
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Functional Characterization of the Receiver Domain for Phosphorelay Control in Hybrid Sensor Kinases. (2015)
  • Author(s): Kinoshita-Kikuta E, Kinoshita E, Eguchi Y, Yanagihara S, Edahiro K, Inoue Y, Taniguchi M, Yoshida M, Yamamoto K, Takahashi H, Sawasaki T, Utsumi R, Koike T.
  • Journal Title: PLoS One Volume: 10 Pages: e0132598
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0132598
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] コムギ無細胞系を基盤としたサイトカイン関連プロテインアレイを用いた カスパーゼ1 新規基質の探索と解析 (2015)
  • Author(s): 増原 有紀, 高橋 宏隆, 桑原 誠, 山下 政克, 澤崎 達也
  • Organizer: BMB2015（第38回日本分子生物学会年会、第88回日本生化学会大会 合同大会）
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド（兵庫県神戸市）
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [Presentation] 脱ユビキチン化酵素CYLDを分解し、がん化を促進するE3リガーゼの同定・解析 (2015)
  • Author(s): 上松 篤史, 高橋 宏隆, 竹田 浩之, 徳永 文稔, 山田 六平, 宮城 洋平, 澤崎 達也
  • Organizer: BMB2015（第38回日本分子生物学会年会、第88回日本生化学会大会 合同大会）
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド（神戸市）
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [Presentation] コムギ無細胞系を用いた287種類のヒトとマウスからなるE3ユビキチンリガーゼプロテインアレイの作製と生化学的解析への応用 (2015)
  • Author(s): 高橋 宏隆, 中島 達朗, 今村 芽依, 高橋 千佳子, 澤崎 達也
  • Organizer: BMB2015（第38回日本分子生物学会年会、第88回日本生化学会大会 合同大会）
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド（兵庫県神戸市）
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [Presentation] コムギ無細胞系を基盤とした脱ユビキチン化酵素CYLDおよびOTULINの阻害剤開発 (2015)
  • Author(s): 山中 聡士, 高橋 宏隆, 徳永 文稔, 澤崎 達也
  • Organizer: BMB2015（第38回日本分子生物学会年会、第88回日本生化学会大会 合同大会）
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド（兵庫県神戸市）
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [Presentation] コムギ無細胞系を用いたキナーゼ基質の探索技術 (2015)
  • Author(s): 澤崎 達也
  • Organizer: 第１５回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: あわぎんホール（徳島県徳島市）
  • Year and Date: 2015-06-24 – 2015-06-26
  • Invited
• [Remarks] CELL-FREE Technology
  • URL: http://www.pros.ehime-u.ac.jp/cell-free/index.html