多剤排出輸送体の構造生物学

2013 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 25291011
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 石谷 隆一郎 東京大学, 理学(系)研究科(研究院), 准教授 (90361568)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: X線結晶構造解析 / 膜タンパク質 / 多剤耐性菌 / 薬物動態

Research Abstract

DHA (Drug-H+ Antiporter) ファミリー輸送体に関しては，多数の細菌ゲノム情報に基づき発現コンストラクトをGFP蛋白質との融合体として作成，大腸菌を用いた小スケールの発現系で発現条件の検討を行った．そして，大腸菌の膜画分を調製，界面活性剤で可溶化後，粗抽出状態でGFPの蛍光を指標としたゲル濾過クロマトグラフィーを行った．その結果，２種の系で単分散性が高い構造解析に適した系を見出すに至った．さらに，これらの系について数リットルの培地を用いた大量培養を行い，膜画分を調製，界面活性剤で可溶化後，Hisタグを用いたNiアフィニティークロマトグラフィーによる精製，プロテアーゼによるGFPの切断，ゲル濾過クロマトグラフィーによる精製を行った結果，高純度でDHA輸送体タンパク質の精製標品を得ることに成功した．現在結晶化スクリーニングを行っている．病原性細菌由来MATEに関しては，MATEの１種に関して上述同様に精製後，結晶化に成功し，大型放射光施設を使用した回折実験により回折データ収集さらには構造決定を行った． その結果，高分解能での外向き開状態の構造決定に成功した．

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

細菌由来DHAとMATEに関しては予定通り計画が進んでおり，今後構造決定と輸送メカニズム解明を目指す．真核生物由来MATEに関しては，構造解析可能なレベルの量・純度・安定性を有する真核生物由来MATE 発現系の網羅的探索を進行中であり，予定通り計画が進んでいる．

Strategy for Future Research Activity

細菌由来MATEに関しては，外向き開状態の構造決定には至ったが，今後はその機能解析と，細菌由来DHAの構造決定に集中する．真核生物由来MATEに関しては，今後構造解析可能な系の探索をさらに進め構造決定を目指す．

Research Products

• [Journal Article] Structural Basis for Potent Inhibition of SIRT2 Deacetylase by a Macrocyclic Peptide Inducing Dynamic Structural Change (2013)
  • Author(s): Yamagata, K., Goto, Y., Nishimasu, H., Morimoto, J., Ishitani, R., Dohmae, N., Takeda, N., Nagai, R., Komuro, I., Suga, H., Nureki, O.
  • Journal Title: Structure Volume: 22 Pages: 345-352
  • DOI: 10.1016/j.str.2013.12.001
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Structural and Functional Analyses of DNA-Sensing and Immune Activation by Human cGAS (2013)
  • Author(s): Kato, K., Ishii, R., Goto, E., Ishitani, R., Tokunaga, F., Nureki, O
  • Journal Title: PLoS One Volume: 8 Pages: e76983
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0076983
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Structural basis for dynamic mechanism of proton-coupled symport by the peptide transporter POT (2013)
  • Author(s): Doki S, Kato HE, Solcan N, Iwaki M, Koyama M, Hattori M, Iwase N, Tsukazaki T, Sugita Y, Kandori H, Newstead S, Ishitani R, Nureki O
  • Journal Title: Proc Natl Acad Sci U S A Volume: 110 Pages: 11343-11348
  • DOI: 10.1073/pnas.1301079110
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Structural Basis for the Counter-Transport Mechanism of a H+/Ca2+ Exchanger (2013)
  • Author(s): Nishizawa T, Kita S, Maturana AD, Furuya N, Hirata K, Kasuya G, Ogasawara S, Dohmae N, Iwamoto T, Ishitani R, Nureki O
  • Journal Title: Science Volume: 341 Pages: 168-172
  • DOI: 10.1126/science.1239002
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Screening and X-Ray Crystal Structure-based Optimization of Autotaxin (ENPP2) Inhibitors, Using a Newly Developed Fluorescence Probe (2013)
  • Author(s): Kawaguchi M, Okabe T, Okudaira S, Nishimasu H, Ishitani R, Kojima H, Nureki O, Aoki J, Nagano T
  • Journal Title: ACS Chem Biol Volume: 8 Pages: 1713-1721
  • DOI: 10.1021/cb400150c
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Structural basis for the drug extrusion mechanism by a MATE multidrug transporter (2013)
  • Author(s): Tanaka Y, Hipolito CJ, Maturana AD, Ito K, Kuroda T, Higuchi T, Katoh T, Kato HE, Hattori M, Kumazaki K, Tsukazaki T, Ishitani R, Suga H, Nureki O
  • Journal Title: Nature Volume: 496 Pages: 247-251
  • DOI: 10.1038/nature12014
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Crystal structure of Cex1p reveals the mechanism of tRNA trafficking between nucleus and cytoplasm (2013)
  • Author(s): Nozawa K, Ishitani R, Yoshihisa T, Sato M, Arisaka F, Kanamaru S, Dohmae N, Mangroo D, Senger B, Becker HD, Nureki O
  • Journal Title: Nucleic Acids Res Volume: 41 Pages: 3901-3914
  • DOI: 10.1093/nar/gkt010
  • Peer Reviewed
• [Presentation] シグナル伝達にかかわる因子Autotaxinの構造ベース創薬 (2014)
  • Author(s): 石谷隆一郎
  • Organizer: 日本薬学会
  • Place of Presentation: 熊本大学（熊本県）
  • Year and Date: 20140330-20140330
  • Invited
• [Presentation] Crystal structure of YidC reveals a membrane protein insertion mechanism (2014)
  • Author(s): Ryuichiro Ishitani
  • Organizer: Gordon Research Conference on Ligand recognition & molecular gating
  • Place of Presentation: Ventura CA, USA
  • Year and Date: 20140323-20140328
• [Presentation] 最先端のマイクロビームラインと計算機シミュレーションを用いた膜輸送体の構造生物学 (2013)
  • Author(s): 石谷隆一郎
  • Organizer: 蛋白質科学会
  • Place of Presentation: とりぎん文化会館（鳥取県）
  • Year and Date: 20130612-20130614
  • Invited
• [Presentation] Structural basis for mRNA surveillance by archaeal Pelota and GTP-bound EF1α complex (2013)
  • Author(s): Ryuichiro Ishitani
  • Organizer: EMBO Conference "Eukaryotic RNA Turnover: From Structural Insights to Diseases"
  • Place of Presentation: Strasbourg, France
  • Year and Date: 20130421-20130425