2014 Fiscal Year Annual Research Report
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25291011
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
石谷 隆一郎 東京大学, 理学(系)研究科(研究院), 准教授 (90361568)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | Ｘ線結晶構造解析 / 膜タンパク質 / 多剤耐性菌 / 薬物動態 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
DMT (Drug-Metabolite Transporter) ファミリー輸送体に関して，多数の細菌ゲノム情報に基づき発現コンストラクトをGFP蛋白質との融合体として作成した．さらに，大腸菌を用いた小スケールの発現系で発現条件の検討を行った．そして，大腸菌の膜画分を調製，界面活性剤で可溶化後，粗抽出状態でGFPの蛍光を指標としたゲル濾過クロマトグラフィーを行った．その結果，２種の系で単分散性が高い構造解析に適した系を見出すに至った．さらに，これらの系について数リットルの培地を用いた大量培養を行い，膜画分を調製，界面活性剤で可溶化後，Hisタグを用いたNiアフィニティークロマトグラフィーによる精製，プロテアーゼによるGFPの切断，ゲル濾過クロマトグラフィーによる精製を行った結果，高純度でDMT輸送体タンパク質の精製標品を得ることに成功した．現在結晶化スクリーニングを行っている．真核生物由来MATEに関しても，多数の真核生物のゲノム情報に基づき発現コンストラクトをGFP蛋白質との融合体として作成した．さらに，ヒト培養細胞を用いた小スケールの発現系で発現条件の検討を行った．そして，膜画分を調製，界面活性剤で可溶化後，粗抽出状態でGFPの蛍光を指標としたゲル濾過クロマトグラフィーを行った．その結果，２種の系で単分散性が高い構造解析に適した系を見出すに至った．現在，大量調製と生成，結晶化を行うべく構造解析を推進している．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
細菌由来DMTとMATEに関しては予定通り計画が進んでおり，今後構造決定と輸送メカニズム解明を目指し，論文投稿へと進める．真核生物由来MATEに関しては，構造解析可能なレベルの量・純度・安定性を有する真核生物由来MATE 発現系の網羅的探索を進行中であり，予定通り計画が進んでいる．
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| Strategy for Future Research Activity |
細菌由来MATEに関しては，外向き開状態の構造決定には至ったが，今後は論文執筆を進める．またDMTに関してはその機能解析と構造決定に集中する．真核生物由来に関しては，今後構造解析可能な系の探索を進め構造決定を目指す．
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[Journal Article] Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of YidC, a membrane-protein chaperone and insertase from Bacillus halodurans2014
Author(s)
Kumazaki K, Tsukazaki T, Nishizawa T, Tanaka Y, Kato HE, Nakada-Nakura Y, Hirata K, Mori Y, Suga H, Dohmae N, Ishitani R, Nureki O
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Journal Title
Acta Crystallogr F Struct Biol Commun
Volume: 70
Pages: 1056-1060
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] Structural basis of Sec-independent membrane protein insertion by YidC2014
Author(s)
Kumazaki K, Chiba S, Takemoto M, Furukawa A, Nishiyama K, Sugano Y, Mori T, Dohmae N, Hirata K, Nakada-Nakura Y, Maturana AD, Tanaka Y, Mori H, Sugita Y, Arisaka F, Ito K, Ishitani R, Tsukazaki T, Nureki O
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Journal Title
Nature
Volume: 509
Pages: 516-520
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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