2014 Fiscal Year Annual Research Report
重イオンビーム欠失変異マッピングによる組換え抑制領域からの有用遺伝子同定
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25292009
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| Research Institution | The Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
風間 裕介 独立行政法人理化学研究所, 仁科加速器研究センター, 協力研究員 (80442945)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
安井 康夫 京都大学, (連合)農学研究科(研究院), 助教 (70293917)
高原 学 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構, 畜産草地研究所 飼料作物研究領域, 主任研究員 (90355123)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 育種学 / 重イオンビーム / 組換え抑制領域 / 植物 / 生殖システム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
染色体の組み換え抑制領域に存在する有用遺伝子を同定するため、組換え抑制領域に大小様々な欠失サイズをもつ変異体ラインを整備し、それらの欠失パターンから原因遺伝子を特定する「欠失変異マッピング」を実施している。
ヒロハノマンテマの2つの性決定遺伝子(雄蕊発達促進：SPF、雌蕊発達抑制：GSF)については、発現が予測される蕾組織をレーザーマイクロダイセクションで切出し、精製したRNAを、1741のY染色体遺伝子を搭載したアレイに供試した。無性花変異体と両性花変異体のつぼみ由来のRNAも供試した。その結果、GSF候補遺伝子として4遺伝子を、SPF候補遺伝子として33遺伝子を同定した。巡回セールスマン問題を用いたY染色体欠失マップの精度を高めた。現在、候補遺伝子とY染色体マップとを統合し、原因遺伝子を絞り込んでいる。
ソバの二花柱型自家不和合性遺伝子については、約3,000個体の重イオンビーム照射集団（M2）を育成し、DNAを抽出した。抽出したDNAをテンプレートに用いてPCR増幅解析を行い、自家不和合性関連遺伝子とされているS－ELF3周辺に欠失が生じた染色体のスクリーニングを実施した。最終的に2個体のS－ELF3周辺に欠失個体を得ることができた。また、アソシエーション解析用集団（短柱花個体24個体、長柱花個体24個体）のDNAを用いてGBS反応とNGS解析を実施した。
ギニアグラスのアポミクシス遺伝子については、イオンビーム照射によりアポミクシスを喪失したと示唆される変異体２系統の表現型解析を行い、後代で遺伝子型・表現型が分離すること、胚のう分析でアポミクシス型胚のうが検出されないことから、これら２系統でのアポミクシス喪失が支持された。BACスクリーニングとNGS解析により、これら変異体の欠失領域のBACコンティグが形成されつつあり、さらにコンティグ連結を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
アポミクシス遺伝子領域の配列の多くを反復配列が占めるため、BACウォーキング・コンティグ作成に時間を要しており、変異体２系統（SM-1, SM-2）の欠失範囲の精密な特定には至っていない。27年度にも引き続き取り組む予定だが、欠失領域への座乗が特定された遺伝子の機能解析も並行して順次進めていく。
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| Strategy for Future Research Activity |
ヒロハノマンテマの2つの性決定遺伝子については、発現アレイで絞り込んだ候補遺伝子がY染色体欠失マップにおける性決定領域と一致するか否かを調査する。性決定領域に存在し、アレイでポジティブであった遺伝子は候補遺伝子として機能解析を進める。一致する遺伝子が1つもなかった場合、SPFとGSF領域のBACシーケンスを進め、性決定領域に存在する遺伝子の中から候補遺伝子を絞り込む。
ソバの二花柱型自家不和合性遺伝子については、GBSを用いたGWAS解析に、昨年度までに得られた重イオンビーム照射によるS領域欠失個体（３個体）のジェノタイピングデータを加味し、ソバゲノムのドラフト配列上でS領域の絞り込みを行う。これによりS－ELF3以外にも存在すると予測されている二花柱性関連遺伝子が検索可能となる。さらに、重イオンビーム照射集団を用いたTILLING解析を実施し、機能欠損型S－ELF3を得る。得られた機能欠損型S－ELF3の花柱性および自家不和合性の表現型を確認することにより、S－ELF3の役割が明らかになる。
ギニアグラスのアポミクシス遺伝子については、アポミクシス欠失変異体２系統についてBACウォーキングを進め欠失範囲を精密に特定する。また未熟花穂のRNA-Seq解析を行い、得られた配列情報をアポミクシス遺伝子領域ゲノム配列にマッピングして、変異体の欠失領域に座乗し、かつアポミクシス胚発生初期で発現する遺伝子を特定する。特定された候補遺伝子は、リアルタイムPCR等による発現解析や系統間の遺伝子構造の比較解析により機能を検証する。
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| Causes of Carryover |
ヒロハノマンテマについて巡回セールスマン問題を用いたマッピングがうまくいき、アレイ解析によりSPF、GSF領域の候補遺伝子も同定できた。現在、これら遺伝子を含むBACクローンをスクリーニング中であり、これらBACを効率的に一度にシーケンスするために、次年度に経費を繰り越した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
27年度は、新たなBACのスクリーニングと、同定したBACの精製および大腸菌ゲノムの消化、BACのシーケンシングのために用いる。
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