2014 Fiscal Year Annual Research Report
| Project/Area Number |
25292062
|
|---|
| Research Institution | Toyama Prefectural University |
|---|
Principal Investigator |
榊 利之 富山県立大学, 工学部, 教授 (70293909)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
加納 健司 京都大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (10152828)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
|
| Keywords | ビタミンD / シトクロムP450 / ビタミンD水酸化酵素 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では二つの課題を並行して実施している。課題１はビタミンD水酸化体の高効率生産で、課題２は血中の２５－ヒドロキシビタミンDの高感度システムの開発である。課題１では、CYP105A1の三重変異体による1α,25-ジヒドロキシビタミンD2の生産が可能になった。分子モデリングによりCYP105A1のMet239の側鎖が立体障害により１α位水酸化反応を妨害していると推測し、Met239を他のアミノ酸に置換したところ、AlaあるいはSer置換体において、25－ヒドロキシビタミンD2に対する１α位水酸化活性が飛躍的に上昇した。また、この三重変異体を放線菌Rhodococcus erythropolisで発現させることにも成功した。この成果により、特許を出願した。課題2では膜結合型シトクロムP450であるCYP3A4およびCYP21A2を用いてP450電極の基礎を固める研究を実施した。ジドデシルジメチルアンモニウムブロマイド（DDAB）存在下でCYP21A2を修飾した電極を用いて電気化学測定を行った。その結果、CYP21A2は酸素の４電子還元反応を触媒し、水分子を生成することがわかった。一方，基質となる17α-ヒドロキシプロゲステロンを添加したが，酵素反応による電流の変化は見られなかった。シトクロムP450の電極への固定化率を上昇させる必要があると考えている。
おおむね順調に進展している。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
課題１については放線菌由来CYP105A1に三重変異体を用いた1α,25-ジヒドロキシビタミンD2の生産が可能になった。すなわち、安価なビタミンD2を基質とし、きわめて高価な1α,25-ジヒドロキシビタミンD2を生産することが可能になり、特許出願につながった。
予想以上の進展が見られたと考えている。一方、課題２については電極への固定化率に問題があることが明確になり、進展がみられたとはいえないが、来年度に向けて方針が明確になった。全体としては概ね順調に進展しているという言い方ができると思う。
|
| Strategy for Future Research Activity |
課題１についてはCYP105A1の三重変異体を発現するRhodococcus erythropolis菌体により1a,25-ジヒドロキシビタミンD2の製造を試みる。また、マウスCYP27B1とその電子供与体であるアドレノドキシンおよびアドレノドキシン還元酵素との同時発現を試みる。また、課題2についてはCYP105A1のC末端に付加したHis-tagを利用することによりN-(５-amino-１-carboxypentyl)iminodiacetic acid (AB-NTA)を用いてCYP105A1の三重変異体を電極表面に配向させ、目的とするP450電極を完成させる。
|
| Causes of Carryover |
試薬、器材などの消耗品費が当初の予定よりも少額で済んだことによる。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
薬、器材などの消耗品を購入する予定である。
|
-
[Journal Article] Synthesis and metabolic studies of 1α,2α,25-, 1α,4α,25- and 1α,4β,25- trihydroxyvitamin D3.2015
Author(s)
Takano M, Sawada D, Yasuda K, Nishikawa M, Takeuchi A, Takagi KI, Horie K,Reddy GS, Chen TC, Sakaki T, Kittaka A.
-
Journal Title
J Steroid Biochem Mol Biol.
Volume: 148
Pages: 34-37
DOI
Peer Reviewed
-
-
[Journal Article] Potent antiproliferative effects of 25-hydroxy-16-ene-23-yne-vitamin D3 that resists the catalytic activity of both CYP27B1 and CYP24A12014
Author(s)
Rhieu SY, Annalora AJ, LaPorta E, Welsh J, Itoh T, Yamamoto K, Sakaki T, Chen TC, Uskokovic MR, Reddy GS.
-
Journal Title
J.Cell. Biochem.
Volume: 115
Pages: 1392,1402
DOI
Peer Reviewed
-
-
-
-
-
-
-
-
-
[Presentation] Protein engineering of actinomycete CYP105A12014
Author(s)
Teisuke Takita, Kaori Yasuda, Yuya Yogo, Hiroshi Sugimoto, Yoshitsugu Shiro Keiko Hayashi, Hiroki Mano, Masaki Kamakura, Miho Ohta, Shinichi Ilkushiro, Kiyoshi Yasukawa, Toshiyuki Sakaki
Organizer
12th International Symposium on cytochrome P450 Biodiversity and Biotechnology
Place of Presentation
京都
Year and Date
2014-09-24 – 2014-09-28
-
-
-
