2013 Fiscal Year Annual Research Report
昆虫体表面物質を規範とした高真空下での生命維持機構の解明と電子顕微鏡技術への応用
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25292198
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Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Research Institution | Hamamatsu University School of Medicine |
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Principal Investigator |
高久 康春 浜松医科大学, 医学部, 特任研究員 (60378700)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
針山 孝彦 浜松医科大学, 医学部, 教授 (30165039)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 電子顕微鏡 / FE-SEM / 高真空 / 生きたまま / 形態学 |
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| Research Abstract |
生物試料は、構成成分の７０～８０％が水であるため、高真空環境（10-5-10-7Pa）を必要とする電子顕微鏡で観察するには、事前の化学固定や脱水が不可欠と考えられてきた。しかしこれらの処理は、試料の変形やアーティファクトを生じさせる為、従来法による観察・解析による結果は、生体本来の構造を正確に捉えてはいなかった。本研究では、昆虫の体表面物質を生物試料の保護溶液として利用し、電子線およびプラズマ照射により、生物試料をナノ薄膜バリアーで覆う（NanoSuit 法）。この方法により、これまで誰も成し得なかった生きた生物の運動/変化をリアルタイム・高解像度で追跡することが可能となる。本課題では、生物が潜在的に備えているバリアー能を模倣・利用するという新しい視点から、革新的電子顕微鏡技術の開発／完成を主な目的とする。
平成２５年度は、NanoSuit 法が節足動物だけに適応できる技術ではなく、五界説で示される原核生物、原生生物、菌類、植物、動物を走査電顕（FE-SEM）内で観察可能になるよう技術の改良を行った（論文投稿中）。NanoSuit の基本原理は、生物が基本的に備えている体表の物質（extra cellular substance; ECS）あるいはECS擬似物質にエネルギー照射し、最表面全体にnanoサイズの膜を形成させることにある（Takaku et al, 2013; Ohta et al, in press）。当初、ECS疑似物質としてTween20を用いていたが、その後NanoSuitの構成コンポーネントとして様々な素材が利用可能であることを明らかにした（Suzuki et al, 2013）。また、保護溶液 Surface Shield Enhancer（SSE、国際特許申請中）を開発し、従来のNanoSuit 法と組み合わせる技術として確立した（論文作成中）。さらに一部の生物を透過電顕で観察できる方法を開発した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
初期の NanoSuit 法は、クチクラ等"やや強固"な外皮を持つ生物において有効であったが、我々は平成２５年度中に NanoSuit法の汎用性を高めて、いわゆる「五界説」すべてに属する生物の観察が可能になった。また、あらゆる試料を生きたまま観察可能にするための保護溶液 Surface Shield Enhancer（SSE、国際特許申請中）を開発し、従来のNanoSuit 法と組み合わせる技術を確立した。当初の研究計画では、新技術の対象生物が限定されていたため昆虫を中心とした節足動物の解析を主眼としていたが、現在はすべての生物を研究対象とし、さらに「切り出した組織」「単一細胞」「ウイルス」等にまで研究の範囲を広げ、それら生きたままの組織・細胞における相互作用に注目し観察／解析を行っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度以降は、『電子顕微鏡を用いて、生きた生物の運動／変化をリアルタイム・高解像度で追跡する』本新技術を発展させ、細胞間で起こる極微細な実運動を可視化する。さらに研究を昆虫以外の生物にも広く展開する。申請らは既に、単一細胞を生きたまま透過型電子顕微鏡で観察することに成功している。この方法を改良することにより、細胞レベルでの長期観察・解析を可能にし、これまでと全く異なる形態学的解析を行う。
我々は、生物のまわりに NanoSuit を形成させることによって、FE-SEM内で生きたまま観察可能にすることに成功した。NanoSuit の基本原理は、生物が基本的に備えている体表の物質（extra cellular substance; ECS）あるいはECS擬似物質にエネルギー照射し、最表面全体にnanoサイズの膜を形成させることにある。しかし、固定した標本や単離組織、そして一部の培養細胞などは、これまでのNanoSuit法を適用しても観察不能であった。そこで現在NanoSuit法の汎用性を高めて、あらゆる試料を生きたまま観察可能にするために、Surface Shield Enhancer（SSE、国際特許申請中）を作成し、従来のNanoSuit 法と組み合わせる技術を開発・検討している。今後は、この技術を完成させ、主に（１）「組織に湿潤する癌細胞の動的観察等」、（２）「培養細胞とウィルスとの相互作用」、（３）「ウィルスを基礎として生物全般の細胞組織との相互作用」を解明する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
当初の計画では、急速凍結試料作成装置（Leica EM CPC、6500千円）を購入予定であったが、研究の進展から、生物試料に与えるダメージを軽減するため、「大気圧プラズマ照射装置」が先に必要になった。そこで魁半導体社製の「大気圧プラズマ照射装置」と栗田製作所の「液中パルスプラズマ発生装置」を比較検討し、平成２５年度は「液中パルスプラズマ発生装置（MPP-HV04-SUS、1000千円）」を優先購入した。
これらの結果から総合的に判断し、まずは「液中プラズマ照射装置」を購入し、実験可能な案件からすみやかに検討を行うことになった。「急速凍結試料作成装置（Leica EM CPC）」に関しては、研究の進展具合によって、今後、再度購入を検討する予定である。
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[Presentation] Dressing living organisms by a thin polymer membrane, NanoSuit, for the FE-SEM observation2014
Author(s)
Hariyama T, Ohta I, Hirakawa S, Kawasaki H, Suzuki A, Ishii D, Muranaka Y, Shimomura M, Takaku Y
Organizer
The 70th Annual Meeting of the Japanese Society of Microscopy
Place of Presentation
千葉 幕張メッセ
Year and Date
2014-05-11 – 2014-05-13
Invited
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