2014 Fiscal Year Annual Research Report
ゲノムエディティングを駆使した遺伝子発現調節法の開発と昆虫制御への応用
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25292202
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| Research Institution | National Institute of Agrobiological Sciences |
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Principal Investigator |
瀬筒 秀樹 独立行政法人農業生物資源研究所, 遺伝子組換えカイコ研究開発ユニット, ユニット長 (70342805)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
新美 輝幸 名古屋大学, 生命農学研究科, 助教 (00293712)
河本 夏雄 独立行政法人農業生物資源研究所, 遺伝子組換えカイコ研究開発ユニット, 主任研究員 (30355747)
冨田 秀一郎 独立行政法人農業生物資源研究所, 遺伝子組換えカイコ研究開発ユニット, 主任研究員 (30360457)
畠山 正統 独立行政法人農業生物資源研究所, 昆虫成長制御研究ユニット, 主任研究員 (50281142)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | ゲノム編集 / ゲノムエディティング / トランスジェニック昆虫 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
カイコでのゲノムエディティング法の開発では、昨年に引き続き、致死や不妊化に関わる遺伝子を含む様々な遺伝子を標的とするTALENを自作し、遺伝子ノックアウト個体の作出を行い、表現型の解析を進めた。また、性フェロモン合成系を標的とするCRISPR/Cas9のgRNAのデザインと合成を行った。さらに、CRISPR/Cas9系の効率を上げるために、Cas9ヌクレアーゼを恒常発現する遺伝子組換えカイコを作出した。今回の実験では、顕著な効率向上は確認できなかったが、プロモーターの変更等の改良が必要かもしれない。
カブラハバチでは、3xP3プロモーターによりEGFP遺伝子を眼で特異的に発現する系統を用いて、EGFPを標的としたTALENのmRNAを卵の前端または後端に微量注射したところ、いずれも注射当代（G0）個体の眼でEGFPモザイクの表現型が確認され、次世代（G1）個体ではEGFP発現が消失した個体が得られた。また、生殖巣特異的に発現する遺伝子の候補として、boule遺伝子の機能解析を進め、カブラハバチのハプロイド雄の精子形成に、boule遺伝子が必須であることを示した。
ナミテントウでも、カブラハバチと同様に3xP3プロモーターによりEGFP遺伝子を眼で特異的に発現する系統を作出し、GFPを標的としたTALENのmRNAを卵の前端または後端に微量注射したところ、いずれもG0個体の眼でEGFPモザイクの表現型が確認され、G1個体ではEGFP発現が消失した個体が得られた。
上記のように本年度は、非モデル昆虫であるハチ目のカブラハバチおよびコウチュウ目のナミテントウにおいて、EGFPという共通のターゲットにしたTALENによる遺伝子ノックアウトに成功し、様々な非モデル昆虫でゲノムエディティングが有効であること示すことに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
TALENやCRSIPR/Cas9を用いたゲノムエディティングは、急速に様々な生物種で世界的に進められており、多くの有益な情報やツールを入手できるため、本研究も効率良く研究を進めることができている。チョウ目カイコでは、自作したTALENによるゲノムディティングが高効率であり、既にルーティン化することができている。
また、EGFP遺伝子をターゲットとする共通のTALENを用いて、ハチ目昆虫（カブラハバチ）で初めてTALENによる遺伝子ノックアウトに成功し、コウチュウ目ナミテントウでも遺伝子ノックアウトに成功しており、非モデル昆虫でのゲノムエディティングの有用性を示すことができたため、達成度は高いと考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでに得られた結果を基にして、カイコ等のチョウ目昆虫では、TALENやCRISPR/Cas9等による遺伝子ノックアウト・ノックインの効率向上をめざしながら、カイコの性決定、不妊化、性行動、性フェロモン合成系等に関わる様々な遺伝子の機能を阻害した個体を作出して、機能解析を進める。また、バイナリ発現システムとの組み合せを検討しながら、条件的な遺伝子ノックアウト・ノックインの誘発法を開発する。
ハチ目昆虫のカブラハバチとコウチュウ目昆虫のナミテントウでは、当初の目的であるゲノムエディティング技術の確立に成功したが、コウチュウ目昆虫に有効な汎用的な可視マーカーの開発と、ナミテントウにおける生殖細胞特異的マーカーの探索と生殖細胞でゲノムエディティングを行う形質転換体の作出を試みる。
以上の研究等を推進することによって、様々な昆虫目で汎用できるゲノムエディティング法、バイナリ発現システム、マーカー遺伝子の開発をめざす。
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| Causes of Carryover |
本研究の一部（カイコおよびコウチュウ目やハエ目における研究）においては研究スキームの検討と実験の立ち上げを重視し、H27年度に集中的に実験等を行って研究を効率的に進めることとした。そのために、次年度使用額を確保する必要があった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
確保した助成金を用いて、カイコおよびコウチュウ目やハエ目における研究において、消耗品または研究補助に対する謝金に当てる等により、H27年度に効率的に研究を推進する。
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[Journal Article] MMEJ-mediated integration of donor DNA in cells and animals using TALENs and CRISPR/Cas92014
Author(s)
Nakade S, Tsubota T, Sakane Y, Kume S, Sakamoto N, Obara M, Daimon T, Sezutsu H, Yamamoto T, Sakuma T, Suzuki KT
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Journal Title
Nature communications
Volume: 5
Pages: 5560
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Presentation] MMEJ-mediated integration of donor DNA in cells and animals using TALENs and CRISPR/Cas92015
Author(s)
Nakade S, Tsubota T, Sakane Y, Kume S, Sakamoto N, Obara M, Daimon T, Sezutsu H, Yamamoto T, Sakuma T, Suzuki KT
Organizer
Keystone symposia
Place of Presentation
Montana, USA
Year and Date
2015-01-11 – 2015-01-16
Invited
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