2014 Fiscal Year Annual Research Report
microRNAによるSrcがん形質発現シグナルの制御
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25293077
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
小根山 千歳 大阪大学, 微生物病研究所, 准教授 (90373208)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | Src / microRNA / がん |
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| Outline of Annual Research Achievements |
今年度は、microRNAとがん形質発現に重要なシグナルネットワークとの関わりを、Srcシグナル制御機構を軸に解明するため、がん形質と相関するmicroRNA について標的分子を解明しシグナル経路について詳細な解析を行った。そのため、昨年に引き続き１）がん形質と相関するmicroRNAの役割の解析、２）Src自身のmicroRNAによる発現制御の解析、３）SrcシグナルによるmicroRNAの発現制御機構の解析を行った。その結果、１）については、Src活性化に伴い発現低下が見られ、再導入によってがん形質を抑制するmicroRNAの標的遺伝子を探索し、細胞接着斑からのシグナルに重要なpaxillinであることを明らかとした。このmicroRNAは、Src活性の高い大腸がんや前立腺がんの細胞株及び組織において発現が低下していた。さらにこれらのがん細胞株を用いて、このmicroRNAの機能を詳細に解析したところ、microRNAによりpaxillinの発現が抑制されると細胞接着斑の形成が不全となり、腫瘍形成や浸潤能の低下に寄与することを明らかとした。さらに２）については、昨年同定したSrc自身の発現を制御するmicroRNAについて、より詳細な機能を解析した。その結果、このmicroRNAはSrcだけでなくSrcががん化シグナルを発信する場である細胞接着斑に存在する分子の発現を同時に抑制し包括的にSrcがん化シグナルを抑制することが明らかとなった。３）については、１）で機能を明らかとしたmicroRNAについて、Srcシグナル下流経路の阻害剤を用いて発現のレスキューを調べたところ、主にSrc下流からRasを介したPI3K経路によって発現が抑制されることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究ではこれまでの研究を発展させ、Srcがん形質発現に関与するmicroRNAとその機構をより包括的かつ詳細に解明することを目標としている。そのため、期間内にSrc によるがん形質と相関するmicroRNA について標的分子を解明しシグナル経路を明らかにすること、さらに細胞内シグナルに加え、細胞間コミュニケーションの解析へと展開させるべく、新たにmicroRNA含有エクソソームの研究に取り組むことを計画している。３年計画の２年目である平成２６年度は、microRNAによるSrcシグナルの亢進とそれに伴う下流microRNAの発現変動及び標的因子の発現調節とその結果としてのがん形質発現機構の解析を行った。その結果、SrcシグナルがmicroRNAを介してSrcがん化シグナルを発信する場である細胞接着斑に存在する分子も同時に制御し、それらが実際のがんにおいても機能していることを見出した。このように今年度の結果を次年度行う予定SrcシグナルによるmicroRNAの発現制御機構やmicroRNAとSrcシグナルの時系列解析につなげることができたことから、概ね順調と判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
来年度は、今年度得られた結果をもとに、１） microRNAとSrcシグナルの時系列解析、２）SrcシグナルによるmicroRNAの発現制御機構の解析、及び３）がん形質とmicroRNA含有エクソソームに取り組む。具体的に１）については、Srcシグナルの誘導発現系を用いて、がん化過程において発現の変動するmicroRNAを経時的にマイクロアレイで追跡する。現在いくつかのmicroRNAが異なるタイミングの発現変動を示すことを見出している。ここでは、より詳細にアレイ解析による網羅的解析と、リアルタイムPCRによる定量的解析に加え、microRNAの標的遺伝子の発現変動も合わせて解析する。発現変動の時系列解析や染色体上の位置からSrcシグナル依存的なmicroRNAの発現制御ネットワークを明らかにしたい。２）については、Srcシグナルに依存するどのような経路でmicroRNAの発現が変化しているのか解析する。具体的には、今年度制御機構を明らかとしたmicroRNA以外について、Srcシグナル下流で重要なPI3K,MAPK経路などの阻害剤等でmicroRNAの発現変化が回復するか調べ、重要なシグナル経路を限定していく。さらにエピジェネティックな機構を考慮し、Srcでがん化した細胞をDNAメチル化阻害剤やヒストン脱アセチル化酵素阻害剤で処理してmicroRNAの発現を解析する。さらに、転写開始点の同定とプロモーター領域のメチル化及びヒストン修飾を詳細に解析したい。さらに、見出されたmicroRNAの発現制御因子の作用を、ノックダウンや遺伝子導入によって確認する。さらに３）については、Srcがん化モデル細胞から放出されるエクソソームががん化以前と異なる蛋白質及びmicroRNAを含有することが示唆されているため、それらの同定とがん形質における放出の意義について解析する。
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| Causes of Carryover |
次年度は、microRNAの発現制御機構解析にあたり様々な観点からのアプローチが必要となること、またmicroRNAの生理的機能や生体におけるがん形質制御機能の解析にあたり作製しているコンデュショナルノックアウトマウスの動物施設利用料に経費が必要となる。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
恒常的経費として、細胞培養、遺伝子工学、生化学実験用の試薬や器具類及び実験動物などの消耗品や各種受託解析の費用として支出する。次年度では多種類のヒト培養細胞を用いた解析を行うため、細胞培養試薬（特に牛胎児血清）及び造腫瘍能の解析のためのマウスなど実験動物に経費を用いる。またこれまでの研究によりがん形質制御に重要と考えられるmicroRNAの生理的機能や生体におけるがん形質制御機能を明らかとするために作製しているノックアウトマウスの動物施設利用料に経費を用いる。さらに、DNA マイクロアレイや２次元電気泳動で変化の見られた蛋白質同定を目的としたマススペクトル受託解析のための経費として使用する。
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