HCV感染に起因する肝病態の進展に係わる宿主因子に関する研究

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 25293110
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 加藤 宣之 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (40150883)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 池田 正徳 鹿児島大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (30315767) ; 佐藤 伸哉 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 助教 (80333558) ; 團迫 浩方 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 助教 (80379841)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: C型肝炎ウイルス / 長期継代培養 / 遺伝子発現変動 / miRNA発現変動 / Exosome / ヒト不死化肝細胞 / RNA複製増殖

Outline of Annual Research Achievements

昨年度に引き続きHCV RNAの長期複製増殖とがん化誘導との関係を解明することを目的として以下の４項目につき研究を行った。
(1)HCVの長期複製により不可逆的発現変動を示した宿主遺伝子に関する解析: 発現レベルが顕著に減少した２遺伝子（CPB2とBASP1）に焦点を絞って、それらの発現制御機構を詳細に検討した。当初、両遺伝子の発現抑制にDNAメチル化の関与が示唆されていたが、検討の結果、CPB2遺伝子では、HNF-1αが発現レベルを規定する因子であること、この遺伝子の発現低下がプロモーター領域のメチル化やHNF-1aの発現低下では説明できず脱メチル化により発現が回復する未知の宿主因子の存在が示唆された。BASP1遺伝子についてもGCボックス様配列がプロモーター活性に重要であったが、メチル化以外の機構の存在が示唆された。
(2)HCVの長期複製により不可逆的発現変動を示すmiRNAに関する解析: 発現が低下する２種類のmiRNAについて、標的遺伝子候補を探索した。得られた幾つかの遺伝子候補のmRNAやタンパク質レベルの発現変動とリンクしているかどうかを検討したが、明確に標的遺伝子であるという結論には至らず、更なる検討が必要であった。
(3)HCVの長期複製によるExosomeの質的変動に関する解析: これまでに開発したExosomeの調製法を用いて、長期に培養継代したHCV RNA複製細胞で検討したところ、Exosomeの量的変動が経時的に起っていることが分かった。
(4)不死化ヒト肝細胞を用いた新規HCV RNA複製細胞モデルの開発: 不死化ヒト肝細胞株PH5CH8にmiR122とClaudin 1を過剰発現させHCV 増殖系の開発を試みた。この過程で特殊な無血清培地を用いるとHCVの産生量が大幅に上昇する現象を見出し今後の開発研究に有用であることが分かった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究の柱である４項目のうち、項目(1)については、当初の計画どおり順調に進展しており、最終年度において目標達成の目処が立つ研究成果が得られた。初年度にHCV RNAの長期複製により生じるHCV遺伝子の変異と多様性獲得動態を詳細に解析することができたため、本研究において解析対象とした２遺伝子との相互作用において、重要な情報になるものと期待できる。項目(2)は、当初順調であったが、miRNAの標的遺伝子の同定の段階で時間を要した。最終年度では、この段階をクリアーすることが必要となった。項目(3)については、初年度にExosomeの精製方法を新たに開発する必要があり時間を要したが、その後、順調に研究が進み、最終年度に目的を達成できる見込みである。項目(4)については、当初から困難な課題であるとは予想していたが、実験の結果、細胞の更なる改良が必要であることが分かった。全体としての進捗状況は、概ね良好で予想していた範囲内にあり、最終年度の研究成果が期待できる。

Strategy for Future Research Activity

本研究は当初の研究計画に沿って概ね進展しているため、推進方策の大きな変更はない。従って、今後も４つの項目について、研究を進めて行く予定である。具体的には、項目(1)については、マイクロアレイ解析などにより目的の宿主因子の同定を行い、CPB2遺伝子の発現低下の原因の解明を目指す。不死化肝細胞でCPB2やBASP1遺伝子を発現させ、細胞にどのような変化が生じるかを調べる。項目(2)については、同定された２種類のmiRNAの標的遺伝子をヒト不死化肝細胞を用いて調べる。項目(3)については、HCV RNA複製細胞の長期継代によるExosomeの質的変動（miRNAも含めて）を定量的に解析する。項目(4)については、HCVの産生を増大させることが分かった無血清培地を用いてmiR122などを追加発現させたヒト不死化肝細胞へのHCV感染を試みる。

Causes of Carryover

効率よく且つ節約しながら研究を進めることができたことが大きな要因である。

Expenditure Plan for Carryover Budget

最終年度のゴールに向けて、費用のかかるマイクロアレイ解析やExosome解析に研究費を投入する。

Research Products

• [Journal Article] Establishment of hepatitis C virus RNA-replicating cell lines possessing ribavirin-resistant phenotypes. (2015)
  • Author(s): Satoh S, Mori K, Ueda Y, Sejima H, Dansako H, Ikeda M, Kato N.
  • Journal Title: PLoS ONE Volume: 10 Pages: e0118313
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0118313
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Anti-HCV activity of the Chinese medicinal fungus Cordyceps militaris. (2014)
  • Author(s): Ueda Y, Mori K, Satoh S, Dansako H, Ikeda M, Kato N.
  • Journal Title: Biochem Biophys Res Commun Volume: 447 Pages: 341-345
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2014.03.150
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Rab18 is required for viral assembly of hepatitis C virus through trafficking of the core protein to lipid droplets. (2014)
  • Author(s): Dansako H, Hiramoto H, Ikeda M, Wakita T, Kato N.
  • Journal Title: Virology Volume: 462-463 Pages: 166-174
  • DOI: 10.1016/j.virol.2014.05.017
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Synthesis and inhibitory activity on hepatitis C virus RNA replication of 4-(1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-hydroxy-2-propyl)aniline analogs. (2014)
  • Author(s): Matsuno K, Ueda Y, Fukuda M, Onoda K, Waki M, Ikeda M, Kato N, Miyachi H.
  • Journal Title: Bioorg Med Chem Lett Volume: 27 Pages: 4276-4280
  • DOI: 10.1016/j.bmcl.2014.07.019
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Alternative endocytosis pathway for productive 1 entry of hepatitis C virus. (2014)
  • Author(s): Matsuda M, Suzuki R, Kataoka C, Watashi K, Aizaki H, Kato N, Matsuura Y, Suzuki T, Wakita T.
  • Journal Title: J Gen Virol Volume: 95 Pages: 2658-2667
  • DOI: 10.1099/vir.0.068528-0
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Hepatitis C virus core protein suppr 1 esses mitophagy by interacting with Parkin in the context of mitochondrial depolarization. (2014)
  • Author(s): Hara Y, Yanatori I, Ikeda M, Kiyokage E, Nishina S, Tomiyama Y, Toida K, Kishi F, Kato N, Imamura M, Chayama K, Hino K.
  • Journal Title: Amer J Pathol Volume: 184 Pages: 3026-3039
  • DOI: 10.1016/j.ajpath.2014.07.024
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Synthesis of 3',4'-difluoro-3'-deoxyribonucleosides and its evaluation of the biological activities: Discovery of a novel type of anti-HCV agent 3',4'-difluorocordycepin. (2014)
  • Author(s): Shimada H, Haraguchi K, Hotta K, Miyaike T, Kitagawa Y, Tanaka H, Kaneda R, Abe H, Shuto S, Mori K, Ueda Y, Kato N, Snoeck R, Andrei G, Balzarini J.
  • Journal Title: Bioorg Med Chem Volume: 22 Pages: 6174-6182
  • DOI: 10.1016/j.bmc.2014.08.024
  • Peer Reviewed
• [Presentation] HCVライフサイクルにおける小胞輸送蛋白質Rab13の役割 (2014)
  • Author(s): 武田 緑、池田 正徳、佐藤 伸哉、團迫 浩方、脇田 隆字、加藤 宣之
  • Organizer: 第62回日本ウイルス学会学術集会
  • Place of Presentation: 横浜
  • Year and Date: 2014-11-10 – 2014-11-12
• [Presentation] 長期にわたるHCV-RNA複製によるBASP1とCPB2遺伝子の発現低下の分子機構の解析 (2014)
  • Author(s): 瀬島 寛恵、佐藤 伸哉、團迫 浩方、池田 正徳、加藤 宣之
  • Organizer: 第62回日本ウイルス学会学術集会
  • Place of Presentation: 横浜
  • Year and Date: 2014-11-10 – 2014-11-12
• [Presentation] HCV-RNAの長期複製によって発現低下したBASP1とCPB2遺伝子の発現制御機構の解析 (2014)
  • Author(s): 瀬島 寛恵、佐藤 伸哉、團迫 浩方、池田 正徳、加藤 宣之
  • Organizer: 第18回日本肝臓学会大会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2014-10-23 – 2014-10-24
• [Presentation] C型肝炎ウイルスRNAの長期細胞内複製によって発現低下した遺伝子の発現制御機構の解析 (2014)
  • Author(s): 瀬島 寛恵 佐藤 伸哉 團迫 浩方 池田 正徳 加藤 宣之
  • Organizer: 第73回日本癌学会学術総会
  • Place of Presentation: 横浜
  • Year and Date: 2014-09-25 – 2014-09-27
• [Presentation] Human hepatoma HuH-7 cell line-derived RSc cells show higher viral productivity in response to infection with HCV-JFH-1 than Huh7.5 cells. (2014)
  • Author(s): Dansako H, Hiramoto H, Ikeda M, Wakita T, Kato N.
  • Organizer: 21th International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses
  • Place of Presentation: Banff, Canada
  • Year and Date: 2014-09-07 – 2014-09-11
• [Presentation] Characterization of anti-HCV activity of N-251, a preclinical antimalarial drug, and its combination effect with DAA (2014)
  • Author(s): Ueda Y, Kim HS, Dansako H, Satoh S, Ikeda M, Doi H, Wataya Y, Kato N
  • Organizer: 21th International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses
  • Place of Presentation: Banff, Canada
  • Year and Date: 2014-09-07 – 2014-09-11
• [Presentation] Analysis on transcriptional regulatory mechanisms of genes whose expressions were reduced during long-term intracellular HCV-RNA replication (2014)
  • Author(s): Sejima H, Satoh S, Dansako H, Ikeda M, Kato N
  • Organizer: 21th International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses
  • Place of Presentation: Banff, Canada
  • Year and Date: 2014-09-07 – 2014-09-11
• [Presentation] Annexin A1 negatively regulates HCV RNA replication (2014)
  • Author(s): Hiramoto H, Dansako H, Takeda M, Satoh S, Wakita T, Ikeda M, Kato N
  • Organizer: 21th International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses
  • Place of Presentation: Banff, Canada
  • Year and Date: 2014-09-07 – 2014-09-11
• [Presentation] DDX21 RNA helicase restricts HCV infection (2014)
  • Author(s): Ariumi Y, Kuroki M, Siddiqui R, Hijikata M, Ikeda M, Wakita T, Kato N
  • Organizer: 21th International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses
  • Place of Presentation: Banff, Canada
  • Year and Date: 2014-09-07 – 2014-09-11
• [Presentation] Rab13 is an essential host factor for HCV entry (2014)
  • Author(s): Tekeda M, Ikeda M, Satoh S, Dansako H, Wakita T, Kato N
  • Organizer: 21th International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses
  • Place of Presentation: Banff, Canada
  • Year and Date: 2014-09-07 – 2014-09-11