抗アポトーシス分子アナモルシンの機能解析 -造血と細胞内鉄代謝における役割-

2013 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 25293220
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 金倉 譲 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (20177489)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 織谷 健司 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (70324762) ; 水木 満佐央 大阪大学, 医学部附属病院, 准教授 (80283761) ; 柴山 浩彦 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (60346202)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: アナモルシン / 鉄硫黄クラスター蛋白 / コンディショナルノックアウトマウス / 細胞内鉄代謝 / 骨髄異形成症候群

Research Abstract

申請者らが、抗アポトーシス分子として単離したアナモルシン（Anamorsin, AM）は既知の抗アポトーシス分子とは類似の構造をもたない新規の分子である。AM欠損マウスは、身体が小さく、胎児肝における二次造血が傷害され、胎生後期に致死となる。申請者らはAMがAMのyeastホモローグであるDre2と同様に鉄硫黄（Fe-S）クラスター形成に関与することを明らかにし、また、Fe-Sクラスター形成のみではなく、細胞内の鉄代謝に重要な役割を果たしていることも明らかにしてきた。本研究では、AMのコンディショナルノックアウトマウスを作成し、各種の造血細胞におけるAMの機能を解析する。さらに、成体マウスの造血幹細胞においてAMを欠損させることで、骨髄異形成症候群（MDS）の病態を示すモデルマウスが作成できるか検討する予定である。
AM遺伝子の通常のノックアウトマウスは胎生致死であり、成体造血におけるAMの機能解析が不可能であった。本研究では、最初に、Cre-loxP system を用いたAMのコンディショナルノックアウトマウスを作成する予定である。その後、各種の造血細胞に特異的なプロモーターの下流でCre recombinaseを発現するトランスジェニックマウスと交配させ、造血幹細胞、Tリンパ球、Bリンパ球など、血液細胞の系統特異的にAMを欠損させたマウスを作成し、それらの表現型を解析する。
本年度は、AMのExon4をloxP配列で挟んだTargeting vectorを、目的の遺伝子座にtargetしたES細胞株を選択し、野生型マウスの受精卵（桑実胚）に注入した。仮親に受精卵（桑実胚）を移植し誕生したキメラマウスと野生型マウスを交配し、ヘテロ欠損マウスを得た。さらに、ヘテロ欠損マウス同士を交配することで、ホモのAMコンディショナルノックアウトマウス（AM loxP KOマウス）を得た。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究計画実施のための土台となるAMコンディショナルノックアウトマウス（AM loxP KOマウス）を得ることができた。
AMコンディショナルノックアウトマウスの作成がうまくいかなかった場合のバックアップの実験として、AMコンディショナルノックアウトマウスを作成するために作成したtargeting vectorを用い、以前AMノックアウトマウスを作成した際に樹立したAM遺伝子ヘテロ欠損ES細胞株に作用させ、AMコンディショナルノックアウトES細胞株を作成することを試みたが、このES細胞株の樹立はいまだ成功していない。

Strategy for Future Research Activity

AMコンディショナルノックアウトマウス（AM loxP KOマウス）と、各種の造血細胞系統特異的に活性化されているプロモーターの下流にCre-recombinaseを発現させたトランスジェニック（Tg)マウスを交配し、造血細胞系統特異的AM欠損マウスを作成し、その表現型を解析する。
具体的には、造血幹細胞、Bリンパ球、Tリンパ球のAMを欠損させるために、Tie-2 Cre Tgマウス、CD19 Cre Tgマウス、lck Cre Tgマウスと交配し、目的のマウスを作成し、その表現型を解析する。また、Mx Cre Tgマウスと交配し、成体となった特定の時期にIFNまたはpIpC処理をおこない、AMを欠損させることによって、成体での造血細胞のAMの機能を評価する。
最初に、Tie-2 Cre Tg-AM loxP KOマウスの造血能および血球形態の観察をおこなう。通常のAMノックアウトマウスは、貧血を呈し、胎生後期に致死となるが、胎児の身体のサイズも小さく、また、胎児線維芽細胞の増殖能も著しく低下していることから、AM KOマウスの死因が貧血によるものかどうかは不明であった。Tie-2 Cre Tg-AM loxP KOマウスを解析することで、in vivoでの造血能におよぼすAMの役割が、より明確になると思われる。AM KOマウスの胎児肝から得た赤芽球細胞は、巨赤芽球様形態を呈し、未分化な細胞の割合が多く、赤血球の分化障害を認める。また、AM KOマウスの細胞内では、Fe-Sクラスター蛋白であるIRP-1やキサンチンオキシダーゼの活性の低下、自由鉄の増加、ROSの蓄積が認められており、AMが欠損することで、鉄の利用障害が起こっている可能性が考えられる。以上のデータから、Tie-2 Cre Tg-AM loxP KOマウスの造血能、特に赤血球系造血は障害されていると思われる。

Research Products

• [Journal Article] Long-term efficacy and safety of eculizumab in Japanese patients with PNH: AEGIS trial. (2013)
  • Author(s): Kanakura Y, Ohyashiki K, Shichishima T, Okamoto S, Ando K, Ninomiya H, Kawaguchi T, Nakao S, Nakakuma H, Nishimura J, Kinoshita T, Bedrosian CL, Ozawa K, Omine M.
  • Journal Title: Int J Hematol Volume: 98 Pages: 406-416
  • DOI: 10.1007/s12185-013-1404-y
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The Satb1 Protein Directs Hematopoietic Stem Cell Differentiation toward Lymphoid Lineages. (2013)
  • Author(s): Satoh Y, Yokota T, Sudo T, Kondo M, Lai A, Kincade PW, Kouro T, Iida R, Kokame K, Miyata T, Habuchi Y, Matsui K, Tanaka H, Matsumura I, Oritani K, Kohwi-Shigematsu T, Kanakura Y.
  • Journal Title: Immunity Volume: 38 Pages: 1105-1115
  • DOI: 10.1016/j.immuni.2013.05.014
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Clinical evaluation of WT1 mRNA expression levels in peripheral blood and bone marrow in patients with myelodysplastic syndromes. (2013)
  • Author(s): Ueda Y, Mizutani C, Nannya Y, Kurokawa M, Kobayashi S, Takeuchi J, Tamura H, Ogata K, Dan K, Shibayama H, Kanakura Y, Niimi K, Sasaki K, Watanabe M, Emi N, Teramura M, Motoji T, Mitani K, Naoe T, Sugiyama H, Takaku F.
  • Journal Title: Leuk Lymphoma Volume: 54 Pages: 1450-1458
  • DOI: 10.3109/10428194.2012.745074
  • Peer Reviewed
• [Presentation] A Rare Genetic Polymorphism In C5 Confers Poor Response To The Anti-C5 Monoclonal Antibody Eculizumab In 11 Japanese Patients With PNH (2013)
  • Author(s): Nishimura J, Yamamoto M, Hayashi S, Ohyashiki K, Ando K, Noji H, Kitamura K, Eto T, Takahashi T, Masuko M, Matsumoto T, Wano Y, Shichishima T, Shibayama H, Hase M, Lan L, Johnson K, Tamburini P, Inazawa J, Kinoshita T, Kanakura Y
  • Organizer: The American Society of Hematology 55th Annual Meeting
  • Place of Presentation: Ernest N. Morial Convention Center, New Orleans, LA, USA
  • Year and Date: 20131207-20131210
• [Presentation] Endothelial Cell-Selective Adhesion Molecule Marks Human Hematopoietic Stem Cells Regardless Of The HSC Sources (2013)
  • Author(s): Ishibashi T, Yokota T, Ichii M, Satoh Y, Sudo T, Doi Y, Fujita N, Nagate Y, Hamanaka Y, Matsui K, Tanimura A, Saitoh N, Ezoe S, Shibayama H, Kincade PW, Oritani1 K, Kanakura Y
  • Organizer: The American Society of Hematology 55th Annual Meeting
  • Place of Presentation: Ernest N. Morial Convention Center, New Orleans, LA, USA
  • Year and Date: 20131207-20131210
• [Presentation] SFRP5 inhibits early B-lymphopoiesis and modulates estrogen-induced changes in the immune system (2013)
  • Author(s): Yokota T, Oritani K, Sudo T, Ishibashi T, Doi Y, Ichii M, Tomizuka K, Yamawaki K, Shimono A, Kanakura Y
  • Organizer: 第75回日本血液学会学術集会
  • Place of Presentation: ロイトン札幌・さっぽろ芸文館・札幌市教育文化会館, 北海道
  • Year and Date: 20131011-20131013
• [Presentation] MS4A3発現はヒト造血における早期骨髄球系分化の指標となる (2013)
  • Author(s): 石橋知彦, 横田貴史, 佐藤友亮, 数藤孝雄, 一井倫子, 柴山浩彦, 江副幸子, 谷村 朗, 藤田奈津子, 松井敬子, 濱中有理, 土居由貴子, 織谷健司, 金倉 譲
  • Organizer: 第75回日本血液学会学術集会
  • Place of Presentation: ロイトン札幌・さっぽろ芸文館・札幌市教育文化会館, 北海道
  • Year and Date: 20131011-20131013
• [Presentation] Analysis of human endosteal HSC niche; a novel CD34high ESAMhigh subset is adjacent to trabecular areas of human bone marrow (2013)
  • Author(s): Ichii M, Oritani K, Yokota T, Ishibashi T, Sudo T, Fujita N, Kincade PW, Kanakura Y
  • Organizer: The 18th Congress of European Hematology Association
  • Place of Presentation: Stockholm International Fairs & Congress Center, Stockholm, Sweden
  • Year and Date: 20130613-20130616
• [Remarks] 大阪大学大学院医学系研究科 血液・腫瘍内科 ホームページ
  • URL: www.hematology.pro