2013 Fiscal Year Annual Research Report

毛誘導に向け最適化したヒトｉＰＳ細胞由来上皮・間葉系細胞による毛包再生の試み

Research Project

Project/Area Number	25293246
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
Research Institution	Keio University
Principal Investigator	大山学慶應義塾大学, 医学部, 講師 (10255424)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	天谷雅行慶應義塾大学, 医学部, 教授 (90212563) 久保亮治慶應義塾大学, 医学部, 講師 (70335256)
Project Period (FY)	2013-04-01 – 2016-03-31
Keywords	再生医学 / ヒト毛包再生 / 細胞・組織 / ヒトiPS細胞
Research Abstract	本研究の目的はヒトiPS細胞を用いて毛包再生を実現する技術の開発である。計画の初年度となる本年度は、ヒトiPS細胞からの効果的なケラチノサイトの誘導法の検討と、毛包形成に重要な毛乳頭細胞をヒトiPS細胞から誘導する前段階としてヒトiPS細胞からの間葉系幹細胞の誘導に取り組んだ。ケラチノサイトに関してはすでに我々は胚様体形成の後レチノイン酸とBMP4の存在下でケラチノサイト無血清培地をもちいて誘導する方法を確立しているが、胚様体形成を経ない直接分化法を試み、前法と比較検討した。しかし、直接分化法では誘導開始後約２０日で著しく細胞の生存率が低下する結果を得たため、この方法の採用は見送ることとした。間葉系細胞の作成に関しては大きく前進した。今までヒトiPS細胞から間葉系幹細胞を効率良く作成する方法は確立したものはなかったが、胚様体形成の後、PDGF、FGF、TGFbetaを添加した無血清間葉系幹細胞培地で11日から13日培養するプロトコールを確立した。これにより得られたヒトiPS細胞由来細胞は　CD90、CD166、CD44などの間葉系幹細胞マーカーを発現し、骨、軟骨、脂肪それぞれの系統に分化する能力を持つことを確認した。また、得られた間葉系幹細胞が、我々が確立したヒト毛乳頭細胞の特性を維持・回復する培養条件で毛乳頭細胞のマーカーを発現することも確認することができた。しかし、間葉系幹細胞は様々な細胞が入り交じったヘテロな細胞集団である。より毛乳頭への分化の効率を上げるためには、この集団の中でさらに多分化能・増殖能の高い細胞を選択する必要がある。その候補の一つがCD271+CD90+の分画である。現在までの解析ではヒトiPS細胞から分化誘導した間葉系幹細胞には骨髄由来のものと比較して高い頻度でこの分画をもつ細胞が含まれることが確認され、今後この分画を使用する目処が立った。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason ヒトiPS細胞からのケラチノサイトの誘導に関しては我々の報告したものも含めていくつかのグループが報告しており技術的には比較的確立されている。毛包再生の要となるのは毛乳頭である。また、ヒトiPS細胞から機能的な（つまりマーカーの発現などではない）間葉系幹細胞の誘導に成功した報告はきわめて数が少ない。つまり、本計画の根幹をなし、また計画の最も高いハードルは毛包間葉系細胞をいかにヒトiPS細胞から誘導するかにかかっている。その点から、実際に間葉系の３系統に分化する能力を有する間葉系幹細胞をヒトiPS細胞から誘導する安定したプロトコールを確立することができたことは計画の確実な前進を示すものであると考えられる。さらに、誘導して得たヒトiPS細胞由来間葉系幹細胞は計画申請時に想定した毛乳頭細胞への分化誘導条件で毛乳頭のいくつかの分化マーカーを発現することも確認できた。また、今年度はプロトコールの確立にとどまるだけでなく、CD271、CD90の発現を利用してヒトiPS細胞から誘導間葉系幹細胞から細胞分画を選択した方が、多分化能・増殖能に富んだ細胞を多く採取できることも明らかにすることができた。ヒトiPS細胞からケラチノサイトへの誘導法に関しては本年度あまり進展がなかった。胚様体を経ず直接分化させる方法は純度が高いケラチノサイトを作成する方法として報告されているが、我々のヒトiPSセルラインを用いる限りにおいて誘導する際の細胞生存率が極めて低く、誘導される細胞分画がヘテロであるなどいくつか問題はあるものの、我々がすでに確立している方法にまさる方法を確立することができなかった。以上より、間葉系細胞の作成の観点のみから判断すればある意味当初の計画以上に進展していると言えるが、上皮系細胞に関しては、技術的に前進することがなかったことを総合的に判断して、おおむね順調に進展していると判断した。
Strategy for Future Research Activity	ヒトiPS細胞からの毛包再生のための上皮細胞の分化誘導に関しては最近、レチノイン酸・BMP4にEGFを加える培養法とバルジ細胞の表面マーカーを利用したソーティングを組合せ、毛包上皮幹細胞に近い特性をもつ細胞を作成するプロトコールが報告されており、本計画においてもこの方法に準じて細胞を準備することが得策と考えられる。従って、今後はよりヒトiPS細胞から毛包間葉系細胞への分化誘導法の確立に力を入れていく予定である。現在の計画ではヒトiPS細胞からCD271、CD90共に陽性の間葉系幹細胞を誘導し、それを毛乳頭細胞に向けて分化・誘導する予定になっている。誘導された細胞については、毛乳頭細胞マーカーの発現のみならず、まず共培養系におけるケラチノサイトとの相互作用などを評価していく必要がある。ここで分化誘導が想定していた通りに進まない場合に問題となるのは、iPS細胞由来間葉系幹細胞に変わる細胞ソースの準備と、より適した分化誘導条件の確立が可能かどうかということになろう。前者に対しては、計画申請書にあるように、ヒトiPS細胞から間葉系幹細胞に類似した神経堤細胞の作成を想定している。また、後者に関しては、ヒト毛乳頭において活性化した転写因子の発現を高める培養条件など、さらに分化誘導条件を改善する予定である。その上で様々なヒトiPS細胞分化分画を毛乳頭のバイオマーカーを用いて、どの分画が優れているのか判断し、それ以降の計画に採用していきたい。また、毛包構成細胞を相互作用させる場（微細環境）がヒト毛包再生にきわめて重要であることが明らかとなってきた。まずはヒト毛包由来細胞を用いて、細胞間相互作用を更に高める条件（３次元構造構築、セルコンパートメンタライゼーションなど）の確立を目指していく。
Expenditure Plans for the Next FY Research Funding	年度末にヒトiPS細胞から間葉系細胞への分化誘導実験を行っていたが、細胞増殖の速度が予想していたより遅かったため、購入を予定していた培地の購入をする必要がなくなった。そのため、培地購入用の資金として予想していた金額を次年度使用額として申請した。本来、前年度内に培地を購入し使用する予定であった細胞が現在増殖しているため、その分化誘導培養に使用する培地購入資金として使用する。