2013 Fiscal Year Annual Research Report
レンサ球菌属のCRISPRスペーサー配列解析による新規流行株予測法の確立
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25305013
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Section | 海外学術 |
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
中川 一路 東京医科歯科大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (70294113)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
丸山 史人 東京医科歯科大学, 医歯(薬)学総合研究科, 准教授 (30423122)
野澤 孝志 東京医科歯科大学, 医歯(薬)学総合研究科, 助教 (10598858)
岡田 和久 大阪大学, 微生物病研究所, 助教 (40420434)
池辺 忠義 国立感染症研究所, 細菌第一部, 研究員 (20333362)
小川 道永 国立感染症研究所, 細菌第一部, 室長 (80361624)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | レンサ球菌 / CRISPR / 流行予測 / スペーサー解析 / 国際研究者交流 / タイ |
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| Research Abstract |
本研究では、日本・タイで流行するレンサ球菌感染症の原因菌であるA群レンサ球菌、肺炎球菌、ブタレンサ球菌を対象として、これらの新規流行株のこれまで行われている血清型分類に加え、CRISPRスペーサー領域の遺伝子配列を比較解析することにより、新規の流行を予測する方法を開発することが目的である．そのため、どのような外来性遺伝子が挿入されるかを予測する基盤を創出する本研究は、病態に応じた安全で有効性の高い治療を提供できることからも高齢者、患者の長寿命化、QOLの向上を見込むことができる．また、日本・タイにおける流行株の予測は、東アジアだけでなく世界的な流行の予測も可能となる可能性を秘めており、社会的にも重要な研究になると考えられる．本研究では、日本・タイで流行するレンサ球菌感染症の原因菌であるA群レンサ球菌、肺炎球菌、ブタレンサ球菌を対象として、これらの新規流行株のこれまで行われている血清型分類に加え、CRISPRスペーサー領域の遺伝子配列を比較解析することにより、新規の流行を予測する方法を開発することに目的がある．特に、タイ北西部、タイ北東部は、インドから東南アジアに向けた不法労働者の流入窓口となっており、他の感染症の流入口となっていることが予測される．そのため、申請者らのグループは、タイ保健省およびチュラロンコン大学の協力のもとに、タイ、特に北部山岳地帯で流行するレンサ球菌感染症の原因菌を収集し、血清型などを解析するとともに、CRISPRスペーサー配列を解析することにより、新規流行株を予測するための技術的基盤を創出する．そのため、平成25年度には、出来うる限りの菌株を収集し、スペーサー配列の塩基情報を解析して次年度の予測が可能かどうかの判定を行う．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
A群レンサ球菌については、タイ保健省および日本の感染症研究所で収集された菌株B群レンサ球菌については、各地点でのサンプリングを行っているが、A群レンサ球菌は、タイでの臨床データが不十分な状態であり、その収集に手間取っている．これは、タイ保健省に集められている菌株が、タイの各地から送られてきたサンプルであるが、その時点で既に臨床データが散逸しているケースが多く、単に菌株としてのみ送付されてきている場合が多い．また、チュラロンコン大学のサンプルについては、比較的臨床データがそろっているが、菌株の保存状態があまりよくない場合が多く、電力状況の不安定さからフリーザー内で死滅している場合も多々見受けられた．肺炎球菌については、高齢者で肺炎が原因となって死亡する例が高いわけではないため、収集そのものがほとんど行われていなかったため、その点についても改善するように指示している．
また、ゲノム解析サンプルについても当初は精製度が低かったため、ゲノム解析に使用できる状況ではなかったが、その点については、実際に現地での指導を行い改善しつつある．特に、安易にキットを使用してゲノムDNAを調整することが見受けられたが、レンサ球菌は細胞壁が強固であるため、キットを使用する場合にはその方法を改善するため菌体溶解酵素の変更や、精製度の確認のための手法を現地にて指導を行った．そのため、現在は、A群レンサ球菌およびブタレンサ球菌について集中的に解析を行っている．平成26年度は、さらにタイでの収集体制を整え、解析を進める．
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| Strategy for Future Research Activity |
平成26年度は、前年の結果を踏まえ、得られた菌株のうち、各地点で分離され、かつ血清型の異なる菌株につい、イルミナGAIIxにて101bp paired-endでシーケンスを行う．このシーケンスについては、東京医科歯科大学に設備があるため、タイの分離株は、タイでゲノムDNAの調整、感染研の株は感染研でゲノムDNAに調整した後に、東京医科歯科大学で解析を行う．得られた配列情報から、CRISPR配列に相当する部分を抽出し、そのスペーサー配列の詳細を、またその前後の塩基配列からスペーサー部分のみを選択的に増幅するプライマーを設計した後に、サンガーシーケンスにて決定する．さらにCRISPRのスペーサー配列には、これまで各菌が感染を受けた外来性遺伝子情報が記録されている．そのスペーサー配列を、各データベースに照合に、どのような外来性遺伝子が記憶されているのかについて解析する．CRISPRでは、構成されるCas遺伝子の直下に、最も近年に記憶された配列が挿入されているため、その配列が入っている位置関係、菌株の分離された地理的状況を加味して、どのような菌が、いつ外来性遺伝子の侵入を受けたのかを解析する．現在CRISPR解析については、日本で分離された菌株についてはほぼ終了しつつあるため、本年度はタイで分離された株で、出自が明らかなものについてさらに解析を進める予定としている．ただし、タイでは、過去において分離された菌株についてはある年度に集中してサンプリングされている傾向があるため、本研究期間中にできるだけ幅広くサンプルを収集する．
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
肺炎球菌のタイでの収集が不十分であったため、若干の研究費の余剰がでた．
平成26年度にタイにおける収集を行い、その際のサンプル調整に用いる．
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[Journal Article] Updating the Vibrio clades defined by multilocus sequence phylogeny: proposal of eight new clades, and the description of Vibrio tritonius sp. nov2013
Author(s)
Sawabe T, Ogura Y, Matsumura Y, Feng G, Amin AR, Mino S, Nakagawa S, Sawabe T, Kumar R, Fukui Y, Satomi M, Matsushima R, Thompson FL, Gomez-Gil B, Christen R, Maruyama F, Kurokawa K, Hayashi T
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Journal Title
frontiers in MICROBIOLOGY
Volume: 4
Pages: 414
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Endogenous Nitrated Nucleotide Is a Key Mediator of Autophagy and Innate Defense Against Bacteria2013
Author(s)
Ito C, Saito Y, Nozawa T, Fujii S, Sawa T, Inoue H, Matsunaga T, Khan S, Akashi S, Hashimoto R, Aikawa C, Takahashi E, Sagara H, Komatsu M, Tanaka K, Akaike T, Nakagawa I, Arimoto H
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Journal Title
Molecular Cell
Volume: 26
Pages: 794-804
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Whole-Genome Sequence of the Purple Photosynthetic Bacterium Rhodovulum sulfidophilum strain W42013
Author(s)
Masuda S, Hori K, Maruyama F, Ren S, Sugimoto S, Yamamoto N, Mori H, Yamada T, Sato S, Tabata S, Ohta H, Kurokawa K
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Journal Title
Genome Announcements
Volume: -
Pages: -
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Complete Genome Sequence of Propionibacterium acnes Isolate from sarcoidosis patient.2013
Author(s)
Minegishi K, Aikawa C, Furukawa A, Watanabe T, Nakano T, Ogura Y, Ohtubo Y,Kurokawa K, Hayashi T, Maruyama F, Nakagawa I, Eishi Y
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Journal Title
Genome Announc
Volume: 1
Pages: e00016-12
DOI
Peer Reviewed
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