2014 Fiscal Year Research-status Report
ヒト末梢血・培養細胞を用いた大気汚染物質の免疫毒性評価法の開発
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25340056
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
堀井 雅恵 名古屋大学, 環境学研究科, 博士研究員 (50644259)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
神林 康弘 金沢大学, 医学系, 講師 (20345630)
中村 裕之 金沢大学, 医学系, 教授 (30231476)
人見 嘉哲 金沢大学, 医学系, 准教授 (70231545) [Withdrawn]
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 化学物質の健康影響 / アレルギー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、黄砂・PM2.5・ディーゼル排気粒子等の大気汚染が問題となっており、その健康影響が懸念されている。これまでにマウス等を用いた動物実験で黄砂やディーゼル排気粒子の気道投与によるアレルギーの増悪が報告されているが、マウスと人では、特に免疫系、代謝系、遺伝的多型の点で違いがある。人に侵襲的な負担をかけずに人への化学物質の暴露影響を調べる方法として、採血した末梢血を用い、体外で化学物質を添加して反応を見るex vivo試験が注目されている。本研究では大気汚染関連の化学物質のアレルギー反応への直接の影響、あるいは化学物質が既知のアレルゲンによるアレルギー反応へ及ぼす影響を、末梢血を用いた体外検査によって検討し、大気汚染関連化学物質に対する個人の感受性を評価する系を開発することを目的として研究を計画した。
ヒト末梢血中の好塩基球のアレルゲンに対する応答が多環芳香族炭化水素（PAH）などの化学物質によって増強されるか、どうかを調べた。好塩基球活性化の指標としてCD63陽性細胞の割合とCD203cの発現上昇をフローサイトメーターで解析した。アレルゲンとしてスギ花粉抽出物、化学物質としてピレン、フェナントラキノンを用いた場合に、スギ花粉症を持つ被験者3名の末梢血において、スギ花粉抽出物単独より、ピレン、フェナントラキノン（7.5nM）とスギ花粉抽出物を混合したものの方が好塩基球の応答が高く、これらの化学物質によるアレルギー応答の増強作用が示唆された。ダニ抽出物をアレルゲンとして用いた場合には、ダニアレルギーを持つ被験者の末梢血においても、この2つの化学物質によるアレルギー応答の増強は見られなかった。化学物質によるアレルギー応答への影響は、アレルゲンの種類によって違いがあり、環境化学物質がアレルゲン蛋白質に何らかの変化を与えることによって、アレルギー応答を増強させている可能性がある。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
平成26年度は、(1)ハイボリュームエアサンプラーによる大気粉塵のフィルター捕集と捕集された粉塵に含まれるPAHの分析、(2)PAHによるアレルギー応答の増強効果を調べるための、アレルギー疾患患者の末梢血を用いた好塩基球活性化試験、(3)粉塵抽出物やPAHがヒト上皮細胞のサイトカイン分泌に及ぼす影響の解析を行なう予定であった。
(1) 大気粉塵のフィルター捕集と粉塵に含まれるPAHの分析については順調に進んでいる。平成26年度中に、粉塵採集地への黄砂の飛来、PM2.5濃度の高い日があり、その時期の粉塵をフィルター捕集することができた。
(2) アレルギー疾患患者を対象とした好塩基球活性化試験については、スギ花粉症の被験者、ダニアレルギーの被験者の末梢血を用いた予備検討を行なうことができた。その結果、アレルゲンとしてスギ花粉抽出物、化学物質としてピレン、フェナントラキノンを用いた場合に、スギ花粉症患者の好塩基球でアレルギー応答の増強が示唆された。ダニアレルギー患者の好塩基球では、化学物質によるアレルギー応答への影響は、アレルゲンの種類によって違いがあり、化学物質がアレルゲン蛋白質に何らかの変化を与えることによって、アレルギー応答を増強させている可能性がある。この結果を踏まえて、喘息などのアレルギー疾患患者を対象とした患者・対照研究を計画し、金沢大学医学倫理審査委員会に倫理申請を行い、承認された。当初の計画よりは遅れているが、25年度には困難と思われた末梢血を用いた好塩基球活性化試験による化学物質のアレルゲン応答の増強効果の検出が可能となった。
(3) PAHのアレルギー応答への影響が示唆されたため、アレルギーに関わる好塩基球・マスト細胞系への影響に限定して研究することにし、ヒト気道上皮培養細胞のサイトカイン分泌に対する粉塵抽出物やPAHの影響を調べる実験は中止した。
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| Strategy for Future Research Activity |
好塩基球活性化試験の結果、ピレン、フェナントラキノンによるアレルギー応答の増強作用が示唆される結果が得られたため、アレルギーに関わる好塩基球・マスト細胞系への影響に限定して研究することにした。
引き続き、アレルギー疾患患者の末梢血を用いた好塩基球活性化試験を行い、データ数を増やして、大気汚染関連化学物質のアレルギー応答への影響を検討する。主に用いるアレルゲンは、アレルギー患者の多いスギ花粉とダニとする。対象の化学物質は増強効果が示唆されたピレン、フェナントラキノンを中心とする。化学物質が、アレルゲン蛋白質や細胞内外の蛋白質を修飾することによって、アレルギー応答を増強させている可能性に着目して、細胞へ添加する物質として、アレルゲン・タンパク質を化学物質との共存在下でインキュベートしたものを用いる。
好塩基球活性化試験による評価法が確立できれば、大気汚染関連の化学物質だけでなく、他の環境化学物質に対する個人の感受性を評価できると考えられる。ピレン、フェナントラキノン以外のPAHや他の化学物質、実際に採取された粉塵抽出物についてもアレルギー応答の影響を調べるべきであるが、末梢血量の確保の点からすべてについて末梢血を用いた好塩基球活性化試験を行なうことは困難である。
そこで、アレルゲン応答に影響のありそうな化学物質のスクリーニングのために、好塩基球マスト細胞系の培養細胞を用いて評価することにした。培養細胞の候補として、好塩基球に分化可能なヒト白血球培養細胞であるKU812細胞を検討しているが、実際の好塩基球と同様のアレルギー応答が確認されておらず、困難が予想される。他の候補として、マスト細胞のモデル細胞として一般的な、ラット好塩基球白血病細胞RBL-2H3を用い、ヒスタミン分泌やβヘキソサミニダーゼ分泌によってアレルギー応答を評価することも検討する。
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| Causes of Carryover |
大気関連化学物質のアレルギー応答への影響においてヒト末梢血を用いた好塩基球試験のデータがまだ不足しているため、統計学的検討や成果発表に至らず、一部の予算が未使用となった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
末梢血を用いた好塩基球活性化試験に関して、必要な抗体類（計15万円程度）、必要なプラスチック類（計5万円程度）、アレルゲンとして用いる蛋白と大気汚染関連の化学物質（計10万円程度）を購入する。培養細胞を用いた実験に関して、細胞培養に必要な薬品類（計10万円程度）、プラスチック類(計10万円程度）、分泌物測定のためのELISAキット（計20万円程度）を購入する。大気粉塵の捕集と含まれるPAHの分析に関して、フィルター(3万円程度×1箱）と試薬(2万円程度）を購入する。
研究打ち合わせと成果発表のための出張費は金沢1-2日×1回（3万円程度）、東京2-3日×1回（5万円程度）を想定した。
(平成26年度未使用額：約3万円＋平成27年度請求額：80万円=計83万円）
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Research Products
(3 results)
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[Journal Article] Effects of Asian dust on daily cough occurrence in patients with chronic cough: A panel study.2014
Author(s)
Higashi T, Kambayashi Y, Ohkura N, Fujimura M, Nakai S, Honda Y, Saijoh K, Hayakawa K, Kobayashi F, Michigami Y, Anyenda EO, Hitomi Y, Nakamura H.
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Journal Title
Atmospheric Environment
Volume: 92
Pages: 506-513
DOI
Peer Reviewed
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