2014 Fiscal Year Research-status Report
改良型二次元インゲルホスファターゼアッセイの確立とホスファターゼ研究の新展開
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25350978
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| Research Institution | Kagawa University |
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Principal Investigator |
亀下 勇 香川大学, 農学部, 教授 (60127941)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
末吉 紀行 香川大学, 農学部, 准教授 (90346635)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | タンパク質リン酸化 / 二次元電気泳動 / プロテインホスファターゼ / インゲルアッセイ / 翻訳後修飾 / 酸化還元 / 活性制御機構 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題は、以下の２点に焦点を絞って研究を実施してきた。（１）ホスファターゼ活性をゲル内で検出するインゲルホスファターゼアッセイ法を確立し、ホスファターゼ研究に応用する。（２）CaMKホスファターゼ（CaMKP）をはじめとして様々なホスファターゼの活性制御メカニズムに関する研究を発展させる。（１）の手法の確立に関しては昨年度ほぼ完了しているので、その手法を用いてPPMファミリーのホスファターゼの研究を進めた。また、CaMKPとCaMKP-N以外のPPMホスファターゼに関しても並行して研究を進めた。まず、インゲルホスファターゼアッセイ法を用いることにより、PPM1A、B、D、E（CaMKP-N）、F（CaMKP）、G、Hの各アイソフォームの活性を検出できることを明らかにした。まずこれらPPMファミリーの各アイソフォームについて酸化、還元処理に対する感受性をインゲルホスファターゼアッセイ法を用いて、分析を行った。PPM1DとHが酸化還元処理に非感受性であるのに対し、それ以外のホスファターゼは酸化還元処理に感受性を示す、つまり酸化処理により活性が低下し、還元処理で活性の増大が見られることがわかった。これらのホスファターゼのアミノ酸変異体を作製し解析を行ったところ、PPM1A、B、E、F、Gにおいては、金属イオン配位部位に存在するAsp残基のN末端側に存在するCys残基の酸化還元によって活性が制御されることが明らかになった。また、インゲルアッセイによりCaMKPの解析を行ったところ、モノマー酵素と考えられていたCaMKPが、モノマー、ダイマーだけでなくオリゴマーを形成することが明らかになった。このようにCaMKPは、酸化還元だけでなくモノマー・オリゴマー転換によっても活性の制御が行われている可能性が示されたので、今後はそのメカニズムの詳細についても解析を進める予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究課題においては、ほぼ当初の年次計画に沿って研究を進めることができた。初年度にインゲルホスファターゼアッセイ法を確立し、その手法を用いることにより様々なホスファターゼの活性を電気泳動後に検出することを可能にした。年次計画通りに、PPMファミリーの各アイソフォームを大腸菌で発現し精製酵素を取得し、それらの解析を進めた。これらのアイソフォームは酸化還元処理を行った際、その感受性がアイソフォームにより異なることを見出した。また、その感受性の原因を明らかにする目的で、様々なアミノ酸変異体酵素を作製し、それらの酸化還元処理に対する感受性を分析した結果、その感受性の差がホスファターゼ活性に重要なメタル配位部位近辺のCys残基の有無に起因することなどを明らかにした。さらにネイティブゲル電気泳動を用いた解析により、CaMKPがモノマーからオリゴマーまで様々な会合状態で存在することを見出し、インゲルアッセイによる分析により、オリゴマーを形成したCaMKPには活性がなく、モノマー酵素がホスファターゼ活性を示すことを明らかにした。これらの発見は、インゲルホスファターゼアッセイを確立したことにより、初めて見出すことができた新事実であり、このような新しい知見が得られた点は、PPMファミリーホスファターゼ研究の流れの中での新展開と考えられる。このような研究成果を総合的に判断すると、本研究課題はおおむね順調に進展していると思われる。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの研究において、CaMKPがオリゴマーの形成により活性制御を受ける可能性が示された。特に、モノマー(活性型酵素)とオリゴマー（不活性型酵素）の可逆的な変換がどのようなメカニズムで制御されているかについては、非常に興味深い課題であり今後その解析を進める予定である。また、PPMファミリーの中でも、PPM1A、PPM1BとPPM1Hの解析を進めてきたが、その中でも特に、PPM1Hは、これまでその機能解析に関してほとんど研究が進んでいないので、そのPPM1Hについては特に力を入れて研究を展開したい。PPM1Hについては、最近、N末端領域とC末端領域のそれぞれを認識する抗体を２種類取得しており、このホスファターゼの発現時期や発現部位などに関しての解析をスタートしたところである。また、ごく最近PPM1Hが多機能性CaMキナーゼにより非常に効率よくリン酸化されるという興味深い現象を見出したので、最終年度には、そのリン酸化部位の決定ならびにリン酸化の意義について明らかにしたいと考えている。このように、今年度はPPMファミリーホスファターゼの活性制御メカニズムに関する研究を展開し、研究成果としてまとめる予定である。
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| Causes of Carryover |
予算は適切に執行したが、次年度以降の研究計画をスムーズに実行するために、消耗品類の使用を節約しながら研究課題に取り組んだために、予定よりも支出を抑えることができた。繰り越した予算は、２７年度の研究を一層効果的に発展させる目的で活用したいと考えている。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
研究計画最終年度に入り、研究課題に取り組む研究室メンバーの仕事も軌道に乗ってきた。そのため、２７年度は研究をさらに発展させる目的で、様々な抗体等消耗品類の購入に予算を使用する予定である。また、スペインで開催される国際学会で研究発表を行うために、海外出張旅費として研究費を使用したいと考えている。
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[Journal Article] Cellular localization of CoPK12, a Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase in mushroom Coprinopsis cinerea,is regulated by N-myristoylation2014
Author(s)
Kaneko, K., Tabuchi, M., Sueyoshi, N., Ishida, A., Utsumi, T., Kameshita, I.
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Journal Title
J. Biochem.
Volume: 156
Pages: 51-61
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] CaMKII is essential for the cellular clock and coupling between morning and evening hehavioral rhythms2014
Author(s)
Kon, N., Yoshikawa T., Homma, S., Tamagata, Y., Yoshitane, H., Shimizu, K., Sugiyama, Y., Hara, C., Kameshita, I., Homma, K., Fukada, Y.
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Journal Title
Gen. Dev.
Volume: 28
Pages: 1101-1110
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Effects of calmodulin on expressionof lignin-modifyingenzymes in Pleurotus ostreatus2014
Author(s)
Suetomi, T., Sakamoto, T., Tokunaga, Y., Kameyama, T.,Honda, Y., Kamitsuji, H., Kameshita, I., Izumitsu, K., Suzuki, K., Irie, T.
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Journal Title
Curr. Genet.
Volume: 14
Pages: 1-14
DOI
Peer Reviewed
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