2013 Fiscal Year Research-status Report
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25430071
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Kitasato University |
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Principal Investigator |
岡田 大助 北里大学, 医学部, 講師 (10211806)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | D-セリン / NMDA受容体 / シナプス可塑性 / 樹状突起スパイン / シナプスタグ |
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| Research Abstract |
1. EGFP融合Homer1a（HE）を用いた光退色後蛍光回復(FRAP)法によりスパインへのタンパク質輸送を直接観察し予備実験の結果を確認した。FRAPにはシナプス活動に依存する成分と、常に作動しシナプス伝達に依存しない自発成分があり、自発成分はNMDA受容体D-セリンサイト拮抗阻害剤DCKAで阻害され、D-セリンで促進される。
2. FRAPの両成分の関係を調べた結果、活動依存的に活性化されるプロテインキナーゼGが樹状突起輸送中のHEタンパク質をD‐セリン依存性スパイン内輸送系に振り分けることが示唆された。HEタンパク質のスパイン内輸送系をD-セリンが調節するという申請時の仮説が支持された。
3. D-セリンの作用標的分子を薬理学的に検討した。D-セリンは小脳ではデルタ2受容体に作用するが、海馬ではデルタ2受容体が発現しないのでNMDA受容体に絞って検討した。NMDA受容体にはサブユニット1‐3があり、生理的アゴニストはグルタミン酸（サブユニット構成1/2）かグリシン（同1/3）である。D-セリンとグリシンはサブユニット1の同じ部位に結合する。サブユニット1阻害薬（DCKA、CGP78608、TPEN）は自発FRAPを阻害した。イフェンプロジル、AP5、Ro256981、MK801及びサブユニット3特異的阻害薬TK30は無効だった。グリシンは自発FRAPを部分的に阻害した。以上から、D-セリンはNMDA型グルタミン酸受容体（サブユニット1/2）に作用し、イオンチャンネル型受容体としての機能とは別の方法でFRAPにおけるスパイン内輸送を起こすことが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究の目的は、D－セリン結合によりNMDA受容体と細胞内外のタンパク質との相互作用が変化する結果、細胞内のタンパク質輸送が起きるという仮説の検証である。細胞内タンパク質輸送はFRAPの自発成分により観察できるというのが申請時の仮説だが、「自発的」な移動には下記のような様々な仕組みが考えられるので、整理が必要である。１）恒常的輸送系があり輸送量は基質供給に依存する、２）輸送系作動を調節するシグナルが通常では恒常的に存在する、３）一過的なシグナルが持続的に輸送を活性化するので（可塑的な輸送系作動）実験条件によっては輸送系が恒常的に見える。これらの可能性について検討した結果が実績概要の2．として示したものである。結果から、上記三つの可能性はいずれもが部分的に正しく、１）プロテインキナーゼG(PKG)による輸送系への基質の「供給」がシナプス伝達依存的で、２）D-セリン濃度が一定に保たれているシナプスではスパイン内輸送系は恒常的に作動し、３）阻害剤の時間依存性実験の結果からPKGによる供給が持続性である、と考えられる。HEタンパク質のスパイン内輸送系をNMDA受容体に作用するD-セリンが調節するという実験計画の大前提が確認できたので、今後の研究の進展に重要不可欠な基盤を得た。また、免疫沈降の条件検討の前にこれらのことが確認できたことにより今後の方法の展望も開けた。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでに得られたスパイン内輸送の知見およびミオシンIIによるスパイ内輸送系は形態的可塑性に関与していること、などから仮説を再構築してみると、NMDA受容体(1/2型)へのD-セリン結合により、HEなどのスパイン内でのミオシン－Fアクチン系上での輸送が可能になるということになる。従って、D-セリンはNMDA受容体に働きかけて何らかのタンパク質を介してF-アクチンとミオシンの相互作用を変化させると考えられる。NMDA受容体の抗体による差分免疫沈降法は直接的なので結果が理解しやすい半面、良い抗体がない。NMDA受容体だけでなくF-アクチン、ミオシンII等を標的にした差分免疫沈降も試すべき方法である。平成26年度はこれらの方法により、シナプス後部画分からのD-セリン差分因子を同定する方向で生化学的検討を開始する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
本研究では大型の機器等の購入予定はなく、実験消耗品が主体であるが、これらは年度初頭などに一括で購入できる性質のものではない。これらは必要に応じて適宜入手するのが現実的で、そのようにしている。会計の締切日から報告書作成迄の間に昨年度分の残額は半分程度になっている。
平成２６年度以降はこれまで行ってこなかった種類の実験を導入するため、消耗品の購入も増えると思われるが、先を見越して計画的に使用していく。主な物は抗体、シナプス画分調製、免疫沈降実験の必要物品である。
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Research Products
(2 results)
