2014 Fiscal Year Research-status Report
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25430071
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| Research Institution | Kitasato University |
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Principal Investigator |
岡田 大助 北里大学, 医学部, 講師 (10211806)
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2013-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | NMDA受容体 / 樹状突起スパイン / シナプス可塑性 / プロテインキナーゼＧ / D-セリン / シナプスタグ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
【目的】ラット海馬初代培養神経細胞単一スパインに光退色後蛍光回復(FRAP)法を適用して、樹状突起からスパインへのタンパク質輸送を直接観察し、EGFPとHomer-1a・EGFP融合タンパク質（H1aEGFP）での仕組みを比較した。昨年度までに、FRAPにはシナプス活動依存成分と、シナプス伝達に依存せずNMDA受容体D-セリンサイトを介して調節される成分の二つがあるという本課題の仮説を支持する結果を得たが、両成分のシナプス活動依存性の差をより明確にするために更に薬理学的検討を行った。
【結果】 H1aEGFPのスパイン移動のシナプス活動依存性成分はPKGの活性化が必要かつ十分であること、EGFPはこの成分の調節を受けないことが分かった。即ち、PKG阻害でH1aEGFP のFRAPは起きず、PKG活性化に必要なNMDA受容体、細胞外カルシウム、一酸化窒素合成酵素等の阻害下（FRAPは起きない）でPKGを直接活性化するとFRAPが起きた。一方で、NMDA受容体GluN1サブユニットD-セリンサイト拮抗薬DCKAはH1aEGFP及びEGFPのFRAPを両方とも阻害した。また、DCKA はPKG活性化剤を用いた直接活性化によるFRAPも阻害した。このDCKAの標的はNMDA受容体GluN1であると考えられる。ウエスタンブロッティングや免疫沈降による分子間相互作用解析の条件検討を開始した。
【意義・重要性】これらの結果から、樹状突起からスパインへのHomer-1aタンパク質輸送機構には、シナプス活動依存性成分と非依存性成分があり、前者はNMDA受容体チャネル活性依存的なPKG活性化がH1aEGFP特異的に行い、後者はH1aEGFPとEGFPに共通で、シナプス活動に依存しないがDCKA感受性である。NMDA受容体構成的活性がD-セリン結合部位依存的スパイン内輸送として初めて実証された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
NMDA受容体の構成的活性はケタミンがNMDA受容体を介してBDNFの発現を調節する際の可能性として提案されているが、具体的な例証が示されたことはない。今回、FRAPに対するケタミンの影響についても調べたが、同サイトに作用するとされるMK801と同様、活動依存性成分に関与すると考えられる結果が得られた。これらの考察から、「NMDA受容体に依存しているがチャネル活性に依存しない作用」が実在するのかをまず結論する必要があると判断し、本年度の実験を行った。PKG阻害剤やカルシウムキレータの作用、EGFPとの違い等を詳細に検討し、D-セリンサイトがHomer-1aの樹状突起からスパインへの輸送に対してNMDA受容体チャネル活性に依存しない調節を行っていることを明確に示すことができた。これがNMDA受容体構成的活性の初めての例示になると思われる。あるということが分かったので、申請当初の目標として掲げたような、D-セリンにより結合が変化するNMDA受容体結合タンパク質の同定を行う意義も十分保証された。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの知見から、シナプス活動依存的に活性化されるPKGと、D-セリン結合NMDA受容体の間にHomer-1aタンパク質のスパイン内輸送系があり、PKG活性がスパイン外からスパイン内にHomer-1aを移すキュー（シナプスタグ）として働き、スパイン内の各種タンパク質は共通の輸送系によりD-セリン結合NMDA受容体依存的にPSD部等に輸送されるという仕組みが仮説として考えられる。この仮説に基づき、FRAPのDCKA依存性成分と輸送系の関係の確認を行う。また、これらの分子間の相互作用の検出を目指す。
スパイン内の膜・タンパク質輸送はアクチン・ミオシン系に依存し、そのカルシウム依存性は、ミオシン軽鎖キナーゼ(MLCK)によるものとトロポミオシンによるものが知られている。スパイン内輸送には複数のミオシンが関わり、GluR1のシナプス膜へのカルシウム依存性輸送にはMyosin Vが、Drebrinの樹状突起へのカルシウム依存性排出にはミオシンⅡが、それぞれ報告されている。FRAPのD-セリン依存性成分はカルシウム流入（細胞外カルシウム）に依存せず、更に細胞内カルシウムをBAPTA-AMでキレートしたところ、スパイン形態が変化しFRAPの測定が困難になった。以上の状況を考え、FRAPを (S)-(-)-ブレビスタチン（ミオシンⅡ阻害剤）やML7（MLCK阻害剤） で阻害し、関与するミオシン分子の種類を特定することで輸送系の関与を確定する。
当初、スパイン内輸送系、PKG、NMDA受容体間の相互作用の生化学的検討にはウエスタンブロッティングや免疫沈降を考えていたが、これらの手法は抗体の性質に依存するのでリスクが高い。相互作用の薬理的側面が解明されたので、PKG活性の有無やD-セリン含量の多寡による二次元電気泳動上の変化などから検討する方がよいと考えこれを実行する。
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| Causes of Carryover |
本研究では大型の機器等の使用予定はなく、実験消耗品が主体であるが、これらは年度初頭などに一括で購入できる性質のものではない。これらは必要に応じて適宜入手するのが現実的で、そのようにしている。基金として年度の境目もシームレスに使えることで実験も途切れずにできている。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
二次元電気泳動関連物品と消耗品、試薬類、実験動物等の物品費と旅費が主な支出と想定される。
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Research Products
(3 results)
